[发明专利]一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用

说明书

本发明涉及动物疫病检测技术领域，具体公开一种LAMP‑Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用。检测鸡毒支原体的引物和探针中，内引物FIP的序列如SEQ ID NO:1，内引物BIP的序列如SEQ ID NO:2，外引物F3的序列如SEQ ID NO:3，外引物B3的序列如SEQ ID NO:4，环引物LF的序列如SEQ ID NO:5，环引物探针的序列如SEQ ID NO:6。利用本发明的引物和探针，可实现对鸡毒支原体的准确检测，且方法可避免非特异性扩增导致的假阳性结果的出现，特异性强、灵敏度高、最低检测限可达0.258fg/μL，对鸡毒支原体的早期临床检测提供了可靠保障。

技术领域

本发明涉及动物疫病检测技术领域，尤其涉及一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用。

背景技术

鸡毒支原体(Mycoplasma galliscepticum，MG)是一种引起鸡呼吸道感染疾病的支原体，不同菌株的感染性和致病性不同，感染后的主要临床表现为流鼻涕、流眼泪、咳嗽，严重时表现为呼吸困难或张口呼吸，可听到湿性啰音。而且鸡感染后一般是隐性带菌，因此，早期筛查是防治的关键。目前，常用的检测鸡毒支原体的方法包括酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，聚合酶链反应(Polymerase chainreaction，PCR)和实时荧光定量qPCR等，但是，上述检测方法均需要复杂的操作程度和昂贵的检测设备，限制了鸡毒支原体的快速筛查。

环介导等温扩增(LAMP)是2000年的一种恒温检测新方法，通常设计两对引物，即外引物(F3/B3)、内引物(FIP/BIP)，分别结合于目的片段上具有较高的特异性。同时，恒温扩增不需要变温循环，理论上一个水浴锅就可以完成实验。为了加快反应速度，还可在上下游内引物的两个组分之前设计两条环引物。因此，LAMP技术与PCR检测技术相比，具有反应快速、设备低廉、操作简单、特异性高等优点。近年来，LAMP恒温检测技术被广泛地应用于食品、微生物、病原体的检测中。

但是，LAMP检测技术依然具有制约其发展的限制条件，如：扩增片段大小不一电泳结果无法直观看到，且引物数量越多，引物错配的概率越高，越容易造成非特异性扩增，产生假阳性结果，以及检出限较高，无法对鸡毒支原体进行早期检测。因此，急需发展一种简便、高特异性、高灵敏度的鸡毒支原体的快速检测方法。

发明内容

针对现有鸡毒支原体的检测方法存在的假阳性概率高、检出限高等问题，本发明提供一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用，利用该检测鸡毒支原体的引物和探针可在62-64℃恒温条件下快速检测鸡毒支原体，且特异性好、灵敏度高，更有利于实现对鸡毒支原体的早期检测，实现疾病的早发现早治疗，有助于预防疾病的扩散。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针，包括：

内引物FIP：5′-CCGCCATTCATACCACCACTAAAGCCTGAACCAAAACCA-3′(SEQ ID NO:1)；

内引物BIP：5′-GGAATGGATAATGCTGCTCCACACCAACTTTTTCAGTTTGACCAT-3′(SEQ IDNO:2)；

外引物F3：5′-CTGAACCAAAGCCAAATCC-3′(SEQ ID NO:3)；

外引物B3：5′-GTCTTTGATTTTTGCATAGTCAT-3′(SEQ ID NO:4)；

环引物LF：5′-GGAGGGTTTGGCATCGGATC-3′(SEQ ID NO:5)；

环引物探针LBP：5′-AGCAGCTGCTAAAACAGCTTTGA-3′(SEQ ID NO:6)。