[发明专利]一种高效高纯度分离细胞线粒体基因组的方法

说明书

本发明属于DNA提取技术领域，具体公开了一种高效高纯度分离细胞线粒体基因组的方法，包括：利用细胞预处理试剂对细胞培养物进行预处理，并收集细胞；利用细胞轻柔裂解液对预处理后的细胞进行裂解；将裂解后的溶液进行离心，分离上清液，纯化得到细胞线粒体基因组；细胞轻柔裂解液包括0.1％～15％NP‑40、0.001～0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.001～0.2mol/L乙二胺四乙酸、0.1～1mol/L醋酸钠、0.1～0.5mol/L醋酸钾和0.001～0.1mol/L柠檬酸钠。本发明方法可以从少量培养细胞中高效获得高纯度线粒体基因组DNA，耗时短，设备要求低，操作简单，重复性好。

技术领域

本发明属于DNA提取技术领域，更具体地，涉及一种高效高纯度分离细胞线粒体基因组的方法。

背景技术

人类线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)约由16569bp组成的呈母系遗传的环状双链DNA，编码37个基因，22种转运RNA与2种核糖体RNA，是细胞内除细胞核以外的独立的第二大基因组信息来源。线粒体基因组的突变率显著高于核基因组DNA(ncDNA)，同时，线粒体为母系遗传，这赋予了mtDNA在个体识别特异性上的独特优势。线粒体是开展人类群体遗传研究的理想材料之一，为研究人类起源、迁移、进化和种族关系提供了独特的信息，并与核基因组分析一起构建了现代遗传考古学。在法庭科学中，线粒体基因组信息对于无核检材(毛发，指甲)、高降解样本(高度腐烂、白骨化尸体)或者一些需要鉴定母系亲缘关系的案例(姐妹关系鉴别)等具有独特的应用价值，在人群属地分析、种族分析、亲缘关系分析等方面都发挥重要作用。同时，线粒体还参与细胞分化、细胞周期、信号转导和细胞凋亡等过程，线粒体功能异常与神经退行性疾病(帕金森氏症和早老性痴呆症)、耳聋、糖尿病、衰老和肿瘤的发生等有密切关系。因此，线粒体基因组分析对遗传疾病筛查、人类遗传学、法医学、考古学等多个领域具有重要价值。

当前线粒体基因组信息的获取主要依靠高通量测序技术及生物信息学分析。但是，核基因组中存在大量核基因组线粒体序列(Nuclear Mitochondrial Sequences，NUMTs)，增加了线粒体组装的复杂性。NUMTs是广泛存在于核基因组上的与线粒体基因组基因高度相似的序列片段，有数百个到上千个NUMTs存在于人的核基因组上，占人核基因组长度的0.87％。简单地以总DNA为模板，通过高通量测序技术获得DNA序列，然后进行线粒体基因组序列挖掘和拼接，所获得的线粒体基因组信息存在一定程度的核基因组污染的可能性，其序列的准确性和可靠性存在不确定性。

当前获得更精细的线粒体基因组的方法主要是通过差速离心或密度梯度离心。根据细胞核和线粒体的沉降系数的不同，依次通过差速离心和密度梯度离心，能够方便地从不同动物组织、植物或酵母中获得大量纯化的细胞核和线粒体。但是，采用差速离心或密度梯度离心方式进行线粒体分离，样本需求量大，损失多。对于稀有样本，如古代残骸的牙齿或法医检材、临床穿刺样本等，样本量少，无法达到进行均浆继而开展多步骤离心操作。同时，对于大量组织样本，也需要复杂的前处理，多步骤分离纯化，需要超速离心机等大型设备，操作繁琐，设备要求高，时间长。其次，有部分文献报道通过特异性探针杂交富集以及长PCR扩增富集等方式获得样本中线粒体DNA的拷贝，进而通过测序获得线粒体基因组信息。但是，这些方法只能针对已知线粒体序列设计特异性探针或引物，无法检测未知的线粒体序列。并且，采用线粒体基因组特异性探针杂交富集以及长PCR扩增富集线粒体基因组信息会引入突变，线粒体基因组信息的保真度难以得到保证，对于精细的遗传信息追踪等工作带来巨大的技术风险。同时，开展序列杂交富集和长PCR扩增需要昂贵的高保真DNA聚合酶，且技术重复性差，批次间结果不稳定。因此，对线粒体高精度遗传分析的客观需求迫切需要一种高效高纯度的线粒体基因组分离方法，为后续开展线粒体相关研究提供最基础的、最可靠的研究材料，在源头上保证了线粒体基因组和细胞核基因组信息不会发生相互干扰和污染。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种高效高纯度分离细胞线粒体基因组的方法，旨在解决现有的分离线粒体基因组的方法存在前处理复杂、操作繁琐、设备要求高或保真度差、重复性不佳等问题。