[发明专利]一种高效高纯度分离细胞线粒体基因组的方法

权利要求书

1.一种高效高纯度分离细胞线粒体基因组的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、利用细胞预处理试剂对细胞培养物进行预处理以去除细胞外杂质DNA，并收集细胞；

S2、利用细胞轻柔裂解液对预处理后的细胞进行裂解；

S3、将裂解后的溶液进行离心，分离上清液，纯化得到细胞线粒体基因组；

其中，所述细胞轻柔裂解液包括0.1％～15％(v/v)NP-40、0.001mol/L～0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.001mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸、0.1mol/L～1mol/L醋酸钠、0.1mol/L～0.5mol/L醋酸钾和0.001mol/L～0.1mol/L柠檬酸钠。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中，所述细胞预处理试剂包括0.001mol/L～0.01mol/L乙二胺四乙酸和0.01mol/L～0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1具体为：将含有1×10²～1×10⁵个细胞的细胞培养物进行1000rpm～2000rpm离心5min～10min，弃上清；接着用生理盐水或PBS缓冲液进行悬浮漂洗，再次以1000rpm～2000rpm离心5min～10min，弃上清；然后用所述细胞预处理试剂进行悬浮漂洗，静置5min～10min，以1000rpm～2000rpm离心5min～10min，弃上清，沉淀即为预处理后的细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2具体为：向所述预处理后的细胞中加入100μL～500μL所述细胞轻柔裂解液，轻柔吹散后，放入冰上处理15min～30min，其间每隔5min颠倒混匀一次。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中包括两次离心过程，具体为：将所述裂解后的溶液在4℃条件下进行3000rpm～3500rpm离心5min～15min，收集第一次上清液；再向沉淀中加入100μL～400μLPBS缓冲液，吹打、悬浮沉淀，然后再次以3000rpm～3500rpm离心5min～15min，收集第二次上清液，将所述第一次上清液和所述第二次上清液混合。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述纯化过程具体为：向分离的上清液中加入等体积线粒体基因组纯化试剂，蜗旋振荡1min～5min，于45℃～60℃水浴处理3min～10min；然后加入一倍体积异丙醇，混匀后置于-20℃静置5min～20min，以10000rpm～15000rpm离心10min～20min；去除上清，所得沉淀即为纯化的线粒体基因组DNA。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述线粒体基因组纯化试剂包括0.001mol/L～0.01mol/L乙二胺四乙酸、0.01mol/L～0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.02mol/L醋酸钠、0.5％～5％(v/v)十二烷基磺酸钠和1μg/μL～5μg/μL蛋白酶K。

8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：还包括步骤S4，以分离的细胞线粒体基因组为模板，分别利用线粒体基因组特异性引物和细胞核基因组特异性引物为引物进行PCR反应，验证分离的细胞线粒体基因组的纯度。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述线粒体基因组特异性引物为：

mitoF:AACATACCCATGGCCAACCT；

mitoR:AGCGAAGGGTTGTAGTAGCCC。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞核基因组特异性引物为：

nF:GAGTTTCCTGGACAAATGAG；

nR:CATTGTTTCATATCTCTGGCG。