[发明专利]一种大肠杆菌全局调控因子环腺苷酸受体蛋白突变体、基因工程菌及应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种大肠杆菌全局调控因子环腺苷酸受体蛋白突变体、基因工程菌及应用。本发明对大肠杆菌全局调控因子CRP蛋白进行改造，对野生型CRP结合口袋的五个关键位点144，112，127，128，83位氨基酸进行组合突变，将112位氨基酸I突变为L、127位T突变为I、144位A突变为T，83位氨基酸S突变为H、128位S突变为P时，有效提高了木糖转运速率和木糖醇生产速率，突变株进行20L发酵罐发酵，41h生产的木糖醇浓度为175.01g/L，木糖醇时空产率4.32g/L/h，木糖转化率100％。本发明还通过CRP蛋白的全局调控，提高了菌株对半纤维素水解液中主要毒性物质，尤其是大分子色素和乙酸盐的耐受性，突变株利用水解液发酵的最大OD₆₀₀可达140。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种大肠杆菌全局调控因子环腺苷酸受体蛋白突变体、基因工程菌及应用。

背景技术

木质纤维素生物质是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，随着化石燃料等不可再生资源的日益枯竭，可再生资源的开发利用逐渐受到人们的重视，利用生物质资源生产生物基化学品和燃料是当前研究的热点。木质纤维素包括纤维素、半纤维素和木质素，其中利用纤维素生产燃料乙醇研究已经很成熟并有工业化生产实例；木质素由于成分较为复杂，研究较为缓慢，并没有取得重大进展；约占木质纤维素原料5％～30％的半纤维研究正引起人们的广泛关注。半纤维素的主要成分是木聚糖，其经过简单的酸解就能获得木糖，利用木糖生产木糖醇从碳元素利用而言，是原料利用率最高的途径之一。木糖醇是来源于木糖的附加值最高、市场需求最大的化学品。木糖醇是一种五碳糖醇，其甜度与蔗糖相当，热量值却只有其60％左右，木糖醇具有抗龋齿及代谢不依赖胰岛素、改善肝功能等特点，广泛应用于食品、医药和化工行业；2004年美国能源部从300多种候选化学品中筛选出12个最具应用前景的来源于生物质的基础化学品，木糖醇就是其中之一。

生物法生产木糖醇相较于化学法具有原料预处理简单、转化效率高、“三废”排放少等优点，已越来越引起人们的兴趣。但是生物法的产业化还存在一些瓶颈，如微生物对半纤维素水解液中的混合糖利用存在相互阻遏的现象，影响混合糖的同步利用；以及未脱毒的玉米芯稀硫酸水解液中含有多种毒性物质，主要包括色素、弱酸以及呋喃衍生物三大类，从而导致细胞生长与生物催化受到抑制。因此，开发木糖转运速率快，且抗逆性强的微生物菌株对于生物法生产木糖醇的产业化应用至关重要。

申请人在公开号为CN104789586A的发明专利申请中公开了一种5拷贝木糖还原酶整合于大肠杆菌基因组IS5序列上的基因工程菌IS5-5，该菌株以纯木糖为底物，采用15-L罐进行补料-分批发酵，100h生产了180.74g/L的木糖醇。

申请人在公开号为CN110734479A的发明专利申请中公开了一种将大肠杆菌的环腺苷酸受体蛋白(CRP)112位氨基酸I突变为L、127位T突变为G、144位A突变为T获得的基因工程菌IS5-5G，该菌株以未经离子交换脱毒的玉米芯水解液为原料，采用15-L罐分批补料进行发酵，78h生产了136.7g/L的木糖醇，生产速率为1.75g/L，木糖醇对木糖的收率为1.0g/g。

虽然，IS5-5G菌株有效缓解了大肠杆菌对混合糖依次利用的代谢产物阻遏效应(CCR)效应，能够利用未经离子交换脱毒的半纤维素水解液发酵生产木糖醇。然而其发酵周期较长，木糖醇产量和时空产率仍有待提高。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明对大肠杆菌全局调控因子CRP进行改造，在消除CCR效应的基础上，进一步提高了工业菌株对纤维素水解液中主要毒性物质的耐受性，克服了对水解液耐受性表型与基因型复杂关系认识的不足，实现了从全局水平上强化工程菌的目标性能。本发明的目的在于提供一种大肠杆菌全局调控因子环腺苷酸受体蛋白突变体、基因工程菌及应用，提供一种大肠杆菌CRP突变株的构建方法，以及该突变株在提高对纤维素水解液中主要毒性物质耐受性方面的作用。

本发明的技术方案如下：