[发明专利]一种分子标记引物及马铃薯晚疫病检测方法

说明书

本发明公开一种分子标记引物及马铃薯晚疫病鉴定方法，分子标记引物用于鉴定马铃薯晚疫病致病疫霉，所述分子标记如序列表SEQ ID NO：1～6所示。鉴定方法包括如下步骤：提取待测材料组织DNA；使用所示分子标记引物进行PCR扩增；PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。本发明提供的三对引物仅在致病疫霉DNA为模板时能获得阳性扩增条带，扩增产物经测序分析与预期序列的相似度分别为94.96％、97.71％、96.44％，而在以辣椒疫霉等近缘种的基因组DNA为模板时均无克隆条带，引物特异性好，能有效区分近缘种。本发明方法可以检测到没有任何病斑、但是已经染菌的叶片，这对病害防控相当重要。

技术领域

本发明属于马铃薯晚疫病基因检测领域，涉及检测马铃薯晚疫病的分子标记引物，以及使用该分子标记引物在马铃薯晚疫病检测方法中的应用。

背景技术

马铃薯的全球种植面积和总产量仅次于水稻、小麦和玉米，是全球第四大作物。我国是全球最大的马铃薯生产国，将马铃薯列为水稻、小麦、玉米之后的第四大主粮。马铃薯生产实践中多采用块茎繁殖，但这种营养繁殖方式易造成病原菌代代相传并不断积累，其中尤以马铃薯晚疫病最为严重。马铃薯晚疫病是一种在全世界绝大多数马铃薯种植区流行的毁灭性病害，是马铃薯最具毁灭性的病害，在马铃薯整个生育期内，只要条件适宜，其病原菌——致病疫霉Phytophthora infestans即可快速产生大量游动孢子，并在短时间内完成数代循环侵染，导致30-60％的产量损失，甚至绝收。时至今日，马铃薯晚疫病每年造成的经济损失依然超过60亿美元，如何有效防控该病害仍是全球面临的共同问题。

传统的晚疫病检测方法包括观察发病症状和分离病原物进行形态学鉴定两种。然而直接观察容易遗漏发病初期的植物材料，且致病疫霉引发的病害易与Pythiumspp.，Fusariumspp. 和Rhizoctoniaspp.引起的病害症状混淆。因此，分离得到致病疫霉菌是非常有必要的。但致病疫霉的分离纯培养有较高的技术要求，且可用于病菌鉴定的形态学特征很少，鉴定起来也比较困难。

分子检测的出现为植物病害的快速、准确诊断提供了新的思路和方法。近年来基于PCR 技术的植物病害分子检测技术在植物病害防治中起着越来越重要的作用。

在实现本发明过程中，发明人发现现有技术中至少存在如下技术问题中的一个问题：

基于转录间隔区(ITS)、线粒体基因Cox1-Cox2等靶标的分子检测技术受限于序列差异小、GC含量高等原因，难以将靶标疫霉菌与其近缘种区分开或不适宜于用作分子靶标。

现有技术中公开了以致病疫霉Ypt1序列为分子靶标，设计了2对引物对11种不同疫霉菌进行检测，结果显示11种疫霉菌均有扩增条带，引物特异性较低。

现有技术还公开了以致病疫霉核糖体DNA转录间隔区(Internal TranscribedSpacer，ITS) ITS-1为检测靶标开发了一套分子检测技术体系，但该检测靶标不能区分近缘种芋疫霉 (Phytophthora colocasiae)、恶疫霉(Phytophthora cactorum)和棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)。

线粒体基因Cox1-Cox2通常GC含量较高，而Lpv基因又少有研究，只针对部分疫霉菌可以进行有效检测，不适用于致病疫霉菌的检测。

病害分子检测体系的建立，关键在于使用合适的分子靶标。

因此，发掘新的分子检测靶标，对于完善致病疫霉分子精准检测体系及提高我国马铃薯晚疫病病害管理水平具有重要意义。

发明内容

鉴于此，本发明目的在于提供一种能够精准检测马铃薯晚疫病的分子标记引物。

本发明的又一目的在于提供一种使用前述分子标记引物检测马铃薯晚疫病的方法。