[发明专利]一种体外快速扩增红细胞技术

说明书

一种体外快速扩增红细胞技术，属于再生医学领域，包括使用低浓度的IL‑β、PEG2以及TGF‑β因子组合（IPT），IL‑β、PEG2以及TGF‑β使用浓度分别为10ng/ml、5ng/ml以及30pg/ml，使用该因子组合可以增加早期红系祖细胞的增殖，加速红细胞分化和脱核，可以将传统21天成熟红细胞培养时间缩短至14天左右，为工业化生成红细胞探索一条可能的道路。

技术领域

本发明涉及再生医学领域，具体为使用低浓度的IL-β、PEG2以及TGF-β因子组合，可以增加早期红系祖细胞的增殖，加速红细胞分化和脱核，可以将传统体外21天成熟红细胞培养时间缩短至14天左右。

背景技术

目前，依靠人工献血的输血系统需要解决的五大问题是：1）血液需求不断增长；2）老龄化社会进程导致献血人口的不断下降； 3) 血液偏型，如稀有血型较难找到匹配者；4）疑难配血，如抗红细胞多重免疫等现象；5）输血安全问题。

从造血干细胞中制造成熟的红细胞用于输血似乎为解决这个世界性的难题提供了一个可能的解决办法，我们已经从不同来源的造血干细胞（骨髓、外周血、胎肝、脐血）中成功在体外诱导出成熟红细胞，并且在小鼠实验中表明这些体外培养的红细胞能够发挥正常红细胞一样的功能，比如携带氧气。并且I期临床试验证明：把自体干细胞在体外扩增成熟的红细胞注入人体内，与人体内的红细胞在各项指标方面基本一致，包括膜弹性、血红蛋白含量以及红细胞体内携运输氧气功能等，完全可以替代人工献血来源的红细胞。

尽管体外诱导生成红细胞为解决临床输血问题提供了一个有力的武器，但是真正实现工业化、规模化体外造血仍然面临着很多技术难题需要克服，其中一个重要的问题是红细胞培养工艺问题，目前在体外从造血干细胞生成成熟红细胞需要21天时间，加之培养每个单位红细胞需要的体积非常大（如果培养瓶平铺那么面积约为4个网球场面积大），难以适应工业化生产需要，急切需要一种能够缩短细胞培养周期，降低细胞培养体积的工艺方法以适应规模化生产的需要。

发明内容

本发明提供一种体外快速扩增红细胞技术，用以解决现有技术中的缺陷。

本发明通过以下技术方案予以实现：使用低浓度IL-β以、PEG2以及TGF-β因子组合可以增加早期红系祖细胞的增殖，加速红细胞分化和脱核，显著加速了终末期红细胞生成过程，从而加快正常成熟去核红细胞的生成：

步骤一：脐带血单个核细胞（MNC）的分离，使用三一造血免疫磁珠法（#FLOSEP-C-034）分离CD34+造血干细胞；

步骤二： CD34+细胞以5x10⁴/ml铺瓶，培养液为P1培养液，以IMDM培养基（Gibco公司）为基础培养基配制，含EPO（sigma公司，3-6U/ml）， INSULIN（sigma公司，50-100ng/ml）、SCF（RD公司，50-100ng/ml）、DEX（SIGMA公司，5-10µM）、IL-3 （sigma公司，5ng/ml）、Heparin（sigma公司，2U/ml）、IL-1β（prepotech 10ng/ml）、PEG2（sigma公司，5ng/ml）、TGF-β（特宝 30pg/ml）置37°C 含5% CO₂条件培养，隔天补液；

步骤三：第8天细胞经洗涤去上清后以1x10⁶/ml转入生物反应器，培养液为P3培养液以IMDM培养基（Gibco公司）为基础培养基配制，含EPO（sigma公司，3-6U/ml）、SCF（RD公司，50-100ng/ml）、DEX（SIGMA公司，5-10µM）、Heparin（sigma公司，2U/ml）、IL-1β（prepotech 10ng/ml）、PEG2（sigma公司，5ng/ml）、TGF-β（特宝 30pg/ml）；

步骤四：第11天换用以IMDM培养基（Gibco公司）为基础培养基配制的培养液，含DEX（SIGMA公司，5-10µM）、Heparin（sigma公司，2U/ml）。