[发明专利]一种基于荧光免疫微球的微生物检查法

说明书

本发明涉及微生物快检领域，为解决现有技术下免疫磁珠检测微生物方法中需要将免疫磁珠与微生物分离后进行染色，操作复杂的问题，公开了一种基于荧光免疫微球的微生物检查法，包括以下步骤：将荧光量子点溶解于有机溶剂中，再加入溶胀后的超顺磁珠反应一段时间后去除上述混合液中的溶剂，得到荧光超顺磁珠；将荧光超顺磁珠活化后与待测微生物抗体混合进行孵育，然后封闭处理得到荧光免疫磁珠；将待测样品与细菌荧光染液或真菌荧光染液混合，再加入荧光免疫磁珠混合孵育，磁分离洗涤后作为待测液加入孔板中观察捕获微生物的荧光免疫磁珠的荧光。该方法在检测过程中无需将免疫磁珠和微生物分离，可进行直接检测，操作方便，检测时间短。

技术领域

本发明涉及微生物快检领域，尤其涉及一种基于荧光免疫微球的微生物检查法。

背景技术

微生物是一群体型微小、结构简单的微小生物，其体型肉眼无法观察到，必须借助显微镜才能看到。微生物是一个庞大的生物群体，涵盖了众多种类，涉及健康、医药、工农业、环保等诸多领域。微生物污染是引发病源性疾病的最主要因素，因此作为卫生管理与安全性指标评价的重要手段，建立快速、准确、灵敏的现代微生物检测方法在安全监控中扮演着更加举足轻重的角色。传统的微生物检查方法存在着操作复杂、测试时间长、耗材使用量大等问题，例如平板培养，需要经过培养基配制、灭菌、倒平板，接种，培养，计数，分离，鉴定等多个操作步骤，测试操作复杂。常规的菌落总数培养时间为48h，为传统方法中用时最少的，而有些苛养菌培养时间甚至超14天。所以为满足微生物安全分析的迫切需求，需开发一种快速、准确、经济、操作方便的微生物检查方法。

免疫磁珠是一种具有超顺磁性的表面修饰磁珠，在磁珠上有特异性结合的抗体。随着磁分离免疫技术的推广应用，人们对病原微生物的免疫磁分离运用越来越多，免疫磁珠的运用亦为微生物检测提供了一种方法。现有使用免疫磁珠进行微生物检测的手段大多都是先用免疫磁珠从样品中捕获微生物，再将微生物和免疫磁珠分离后检测微生物的存在。例如，在中国专利文献上公开的“基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法及试剂盒”，其公告号为CN110596383A，鉴别方法为：(1)制备通用桥连磁珠：a)制备磁珠-链霉亲和素交联物；b)制备生物素-Ab2交联物；c)制成通用桥连磁珠：将磁珠-链霉亲和素交联物与生物素-Ab2交联物混合孵育，制得通用桥连磁珠；(2)制备特异捕捉磁珠：将通用桥连磁珠与待测病原微生物的鼠源性Ab1混合，即得；(3)将待测样品与特异捕捉磁珠混合、孵育，磁分离洗涤，得到免疫磁珠分离物；(4)加入脱磁液孵育，磁分离，取上清涂片，加细菌染液或真菌染液，检测观察菌体着色状况。该方法将磁珠与待测细菌分离后再将细菌染色观察，操作较为复杂。

发明内容

本发明为了克服现有技术下免疫磁珠检测微生物方法中需要将免疫磁珠与微生物分离后进行染色，操作复杂的问题，提供一种基于荧光免疫微球的微生物检查法，该方法在检测过程中无需将免疫磁珠和微生物分离，可进行直接检测，操作方便，检测时间短。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于荧光免疫微球的微生物检查法，包括以下步骤：

(1)将荧光量子点溶解于有机溶剂中，再加入溶胀后的超顺磁珠反应一段时间后去除上述混合液中的溶剂，得到荧光超顺磁珠；

(2)将荧光超顺磁珠活化后与待测微生物抗体混合进行孵育，然后封闭处理得到荧光免疫磁珠；

(3)将待测样品与细菌荧光染液或真菌荧光染液混合，再加入荧光免疫磁珠混合孵育，磁分离洗涤后作为待测液加入孔板中观察捕获微生物的荧光免疫磁珠的荧光。

本发明将荧光量子点包埋于超顺磁珠中得到荧光超顺磁珠，再将荧光超顺磁珠与待测微生物抗体结合得到可特异性识别微生物的荧光免疫磁珠，将待测样品中微生物进行染色再与荧光免疫磁珠结合可实现直接检测荧光，若待测液只有荧光超顺磁珠发出荧光值，那么检测结果为阴性；若待测液中同时有荧光超顺磁珠发出的荧光值和被染色的微生物发出的荧光值，那么检测结果为阳性。使用不同的荧光量子点以及抗体可得到不同的荧光免疫磁珠，进而实现多种微生物的检测。