[发明专利]小片段DNA的检测方法及检测试剂盒

说明书

本发明公开了小片段DNA的检测方法及检测试剂盒，属于基因检测技术领域。所述检测方法为：(1)针对目标检测基因，设计得到特异性正向引物、特异性反向引物和探针；在特异性的正向引物的5’端连接一段含有延伸阻滞剂的茎环结构得到茎环引物；所述探针的5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭基团BHQ；(2)QPCR检测。所述检测试剂盒包括针对目标检测基因设计的茎环引物、特异性正向引物、特异性反向引物和探针，以及QPCR检测方法所必需的试剂。本发明的检测方法，在单管中即可实现目标片段的检测，操作简便、快速，灵敏度高，特异性强，检测结果准确，适用于血清、血浆等样本的游离DNA的简单快读提取和SRY性别鉴定。

技术领域

本发明涉及一种小片段DNA的检测方法及检测试剂盒，属于基因检测技术领域。

背景技术

实时荧光定量PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction，qPCR)是能够定量监测目的基因扩增数量的PCR技术，其原理是在PCR体系中加入荧光染料或荧光分子标记的寡核苷酸链，与PCR扩增产物结合时荧光分子在紫外线的激发下发出荧光，通过荧光信号探测器直接检测反应体系中荧光信号的变化，检测监测目的基因的拷贝数量，并据此推断目的基因的初始量。

TaqMan探针是当前使用最广泛的水解荧光探针，其5'端标记了荧光发射分子，3'端标记了荧光淬灭分子，当TaqMan水解探针处于游离状态时，两端的荧光分子相互靠近，在紫外线的激发下荧光被吸收，无法被荧光探测器检测到。随着PCR反应的进行，TaqMan探针与目的基因发生特异性结合，5'端的荧光发射分子被DNA合成酶水解，在空间上脱离了荧光受体分子的影响，在紫外线的激发下产生荧光，并被荧光信号探测器所捕获。通过绝对定量或相对定量的方式对样本核酸量和扩增片段数量进行定量估计。

近年来出现了在TaqMan探针的3'或5'端连接MGB配体以提高探针灵敏度和特异度的方法。MGB(Minor groove binding)配体是一种三肽分子，能选择性地与富含AT两种碱基的双链DNA螺旋小沟发生非共价结合。MGB探针的一端以非荧光淬灭分子代替荧光淬灭分子，减少了背景荧光信号强度。MGB探针与靶基因的结合更加稳定,MGB能提高探针的Tm(MeltingTemperature，熔融温度)值，因此能够将探针设计地更短，有利于针对病毒的多种基因型的相同位点而设计通用探针；同时使探针能够分辨一个碱基的差别，当存在一个碱基不同时就无法在一定波长紫外线的激发下发出荧光，因此能够进行基因点突变的检测；MGB探针发生错配的概率更小，减少了非特异性扩增产物的出现。但是，若检测的目标片段过小(小于200bp)，则目标片段的引物设计无法在常规引物和双标记Taqman探针设计软件实现，无法在常规的PCR或者QPCR实验中完成。

SRY基因是雄性的性别决定基因，指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段。人的SRY基因位于Yp11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。SRY基因是目前认为的唯一一个性别决定基因，可以在血液、精液样本中寻找该基因片断以判断测试者性别，通常采用的方法是，先使用PCR技术扩增该基因上某个片断，再利用凝胶电泳判断样本中是否含有该基因，若测试者是男性，样本中存在该基因，

测试为阳性，女性测试者将会相应得到阴性结果。目前，SRY基因检测对医学、遗传学、优生学、动物育种学、法医学等领域的研究和应用都具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种小片段DNA的检测方法，以及检测试剂盒，特异性强，可以快速、准确地检测40～200bp的小片段DNA(例如陈旧样本中由于细胞凋亡而降解产生的游离DNA)，尤其是人SRY基因的小片段DNA。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种小片段DNA的检测方法，包括以下步骤：