[发明专利]小片段DNA的检测方法及检测试剂盒

权利要求书

1.一种小片段DNA的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)引物和探针的设计：针对目标检测基因，设计得到特异性正向引物、特异性反向引物和探针；

在特异性的正向引物的5’端连接一段含有延伸阻滞剂的茎环结构得到茎环引物，所述含有延伸阻滞剂的茎环结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第11、13、15位的碱基为5－甲基胞嘧啶；

SEQ ID NO.1：5’-AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCT-3’；

所述探针的5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭基团BHQ；

(2)QPCR检测：提取待检测样品中的小片段DNA，利用步骤(1)中设计得到的引物和探针，利用QPCR检测方法进行扩增和检测，根据检测结果，判断待检测样品中是否含有目标检测基因。

2.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法，其特征在于：所述目标检测基因为人SRY基因；所述茎环引物、特异性正向引物、特异性反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.2～5所示，其所针对的是40bp的小片段DNA；

SEQ ID NO.2：

5’-AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTTCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCA-3’；

SEQ ID NO.3：5’-CACACGATGAATGCGT-3’；

SEQ ID NO.4：5’-TCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCA-3’；

SEQ ID NO.5：5’-TAGAGTGAAGC-3’。

3.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法，其特征在于：所述目标检测基因为人SRY基因；所述茎环引物、特异性正向引物、特异性反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.6～9所示，其所针对的是62bp的小片段DNA；

SEQ ID NO.6：

5’-AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTAGAGTGAAGCGACCCATGA-3’；

SEQ ID NO.7：5’-GCCATCTTGCGCCTC-3’；

SEQ ID NO.8：5’-AGAGTGAAGCGACCCATGA-3’；

SEQ ID NO.9：5’-TCGTGTGGTCTCG-3’。

4.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法，其特征在于：所述目标检测基因为人SRY基因；所述茎环引物、特异性正向引物、特异性反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.10～13所示，其所针对的是84bp的小片段DNA；

SEQ ID NO.10：

5’-AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTTGGATAGTAAAATAAGTTTCG-3’；

SEQ ID NO.11：5’-GAAGCATATGATTGCATTG-3’；

SEQ ID NO.12：5’-TGGATAGTAAAATAAGTTTCG-3’；

SEQ ID NO.13：5’-GCACCTTTCAATTTTGTCG-3’。

5.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法，其特征在于：所述待检测样品为血浆样本。

6.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法，其特征在于：所述QPCR检测的反应体系为：2x iTaq Probe QPCR mix，10μl；引物混合物，浓度为10μmol/L，1μl；探针，浓度为10μmol/L，0.5μl；碎片化DNA，5μl；水，3.5μl；共20μl；

所述QPCR检测的反应条件设置为：95℃3min；95℃，20s→50℃，60s，10个循环；95℃，10s→60℃，30s，40个循环。