[发明专利]一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体及其应用，属于生物工程技术领域，包括突变体质粒KPHS‑H231Y，所述突变体质粒KPHS‑H231Y的氨基酸位点231位碱基gaa突变为tac，所述突变体质粒由实验室构建的KPHS质粒通过定点突变的方法制备，本发明的突变体质粒KPHS‑H231Y参与的原儿茶酸乙酯的合成反应显著提高了原儿茶酸乙酯产量，突变株的生产方式绿色环保且具有创新性。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体及其应用。

背景技术

原儿茶酸乙酯，白色或浅棕黄色结晶性粉末，属于酚酸类化合物，是一种食品添加剂，可用于油脂，奶油的防氧化，市场量较大。目前，原儿茶酸乙酯的生产方式是化学合成，但以生物合成的方式进行生产却很少报道，原因大多是原儿茶酸乙酯生物合成途径中的关键酶基因KPHS活性较低，使得产品产量较低。而定点突变目前是改造、优化基因的便捷方案，是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具。

发明内容

针对上述存在的技术不足，我们通过定点突变的方法发现了关键酶基因KPHS的氨基酸位点Glu231突变为Tyr231能够增强关键酶基因KPHS活性，基于该突变，本发明的目的是提供一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体，其特征在于，包括突变体质粒KPHS-H231Y，所述突变体质粒KPHS-H231Y的氨基酸位点231位碱基gaa突变为tac，所述突变体质粒KPHS-H231Y由实验室构建的KPHS质粒通过定点突变的方法制备。

优选的，所述突变体质粒KPHS-H231Y的核酸序列如SEQ NO.1所示。

优选的，所述定点突变方法具体为：

S1、以质粒KPHS为模板，进行聚合酶链式（PCR）反应，获得PCR产物；S2、采用消化酶Dpn1消化PCR产物并使用纯化试剂盒进行纯化，得到纯化的PCR产物；S3、取纯化的PCR产物以化学转化法导入大肠杆菌克隆菌株感受态细胞中，待长出菌落后挑取单菌落进行培养；S4、利用质粒提取试剂盒抽提质粒得到突变体质粒KPHS-H231Y。

优选的，所述质粒KPHS为实验室构建的质粒。

优选的，所述聚合酶链式反应的反应条件为：95℃变性，50-60℃退火，72℃延伸，循环35次。

优选的，取纯化的PCR产物0.1-10ul以化学转化法导入大肠杆菌克隆菌株感受态细胞中。

优选的，对所述突变体质粒KPHS-H231Y进行表达量检测包括：

将突变体KPHS-H231Y导入大肠杆菌表达菌株感受态细胞中，获得突变株KPHS-H231Y；

培养：利用LB液体培养基对突变株KPHS-H231Y进行培养，培养参数设定为温度30-37℃，转速200-225rpm；

诱导表达：当培养液中的细胞OD600为0.2-1.2时，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷对培养完毕的突变株KPHS-H231Y进行诱导表达，其中，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度为0.2mM，诱导表达参数设定为温度20-30℃，转速120-200rpm，稳定培养2小时后取样；

表达量检测：将取样的样品进行离心，弃培养基留菌体，加入缓冲液并使用细胞破碎仪破碎细胞，离心弃沉淀取上清，将上清蛋白置于100℃加热10分钟变性，获得上样蛋白，将上样蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳，其中，设定电压120V，时间40分钟，得到的蛋白胶进行染色脱色后，进行突变体KPHS-H231Y的蛋白检测。

本发明通过将关键酶基因KPHS的氨基酸位点Glu231突变为Tyr231获得突变体质粒KPHS，促进原儿茶酸乙酯的生物合成，基于此，本发明的另一目的是提供一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体的应用，该突变体提高了原儿茶酸乙酯产量，其特征在于，所述突变体质粒KPHS-H231Y表达的蛋白用于参与以羟基苯甲酸乙酯为底物合成原儿茶酸甲酯的合成反应。