[发明专利]一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体及其应用

权利要求书

1.一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体，其特征在于，包括突变体质粒KPHS-H231Y，所述突变体质粒KPHS-H231Y的氨基酸位点231位碱基gaa突变为tac，所述突变体质粒KPHS-H231Y由实验室构建的KPHS质粒通过定点突变的方法制备。

2.如权利要求1所述的一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体，其特征在于，所述突变体质粒KPHS-H231Y的核酸序列如SEQ NO.1所示。

3.如权利要求1所述的一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体，其特征在于，所述定点突变方法具体为：

S1、以质粒KPHS为模板，进行聚合酶链式反应，获得PCR产物；S2、采用消化酶Dpn1消化PCR产物并使用纯化试剂盒进行纯化，得到纯化的PCR产物；S3、取纯化的PCR产物以化学转化法导入大肠杆菌克隆菌株感受态细胞中，待长出菌落后挑取单菌落进行培养；S4、利用质粒提取试剂盒抽提质粒得到突变体质粒KPHS-H231Y。

4.如权利要求3所述的一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体，其特征在于，所述聚合酶链式反应的反应条件为：95℃变性，50-60℃退火，72℃延伸，循环35次。

5.如权利要求1-4任一所述的一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体的应用，其特征在于，所述突变体质粒KPHS-H231Y表达的蛋白用于参与以羟基苯甲酸乙酯为底物合成原儿茶酸甲酯的合成反应。

6.如权利要求5所述的一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体的应用，其特征在于，所述突变体质粒KPHS-H231Y表达的蛋白参与的合成反应具体步骤为：

将所述突变体质粒KPHS-H231Y导入大肠杆菌表达菌株感受态细胞中；

利用LBS培养基对所述大肠杆菌表达菌株进行恒温培养；

对培养结束的大肠杆菌表达菌株使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达；

往诱导结束反应液中加入对羟基苯甲酸乙酯底物，反应5-8小时，得产物原儿茶酸乙酯。

7.如权利要求6所述的一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体的应用，其特征在于，所述恒温培养条件为：温度30-37℃，转速200-225rpm。

8.如权利要求6所述的一种原儿茶酸乙酯生物合成途径关键酶基因突变体的应用，所述诱导表达用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度为0.2mM，诱导表达条件为温度20-30℃，转速120-200rpm，诱导时间为2小时。