[发明专利]靶向沉默辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1的植物表达载体及其应用

说明书

本发明公开了靶向沉默辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因的植物表达载体及其应用。本发明涉及的植物表达载体可以转录形成具有反向互补结构的双链RNA，由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核酸序列分别正、反向插入载体构成。本发明还公开了这些表达载体在防治辣椒疫霉引起的植物病害上的应用。表达本发明涉及的载体的植物对辣椒疫霉的抗病性明显增强，侵染这些植物的辣椒疫霉的氧化固醇结合蛋白1基因表达受到了显著抑制，由于氧化固醇结合蛋白1基因对于辣椒疫霉的发育和致病是必需的，因此本专利涉及的植物表达载体可有效抑制辣椒疫霉对植物的侵染，为防治辣椒疫霉引起的相关病害提供了一种有效途径。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及两种具有茎环结构转录本抑制辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因表达的植物表达载体，以及这些植物表达载体在防治辣椒疫霉引起的植物病害上的应用。

背景技术

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是一种重要植物病原卵菌，在世界各地均有分布，可侵染茄科、豆科及大多数葫芦科的70多种植物，引起猝倒、萎蔫和根、茎、果实腐烂，从苗期至果期均能发病，造成严重的经济损失。辣椒疫霉引起的辣椒疫病是一种毁灭性病害，可经雨水、土壤和气流等途径传播，造成叶片枯萎、果实腐烂，甚至全株枯死等症状，对作物产量、品质影响极大，严重时可导致减产50％以上。

对辣椒疫霉的防治主要依赖于化学防治，但由于杀卵菌剂的种类较少，长期单一使用化学农药已导致辣椒疫霉对多种化学农药产生抗药性，且不断增大剂量施用化学农药对于环境造成严重污染。此外，对辣椒疫霉具有抗性的植物品种资源匮乏，亟需开发新型手段防治辣椒疫霉引起的植物病害。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA诱发的基因沉默现象，其可以通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。RNAi在生物体内普遍存在，DNA转录形成的双链或发卡结构的RNA序列可以被加工为20-30bp之间的小RNA，这些小RNA通过介导基因沉默复合体特异识别与之互补配对的靶基因DNA或mRNA序列，造成mRNA的切割、翻译抑制或DNA甲基化，最终抑制基因的正常表达(Fire,A.等.1998.Nature.391(6669):806)。寄主诱导的基因沉默技术(Host-induced gene silencing,HIGS)是基于RNAi的原理，在寄主植物中表达靶向病原物关键基因的沉默载体即HIGS介体，当病原物入侵寄主植物时，由HIGS介体剪切加工生成的小RNA在转录后水平沉默病原菌重要基因，从而保护植物免受侵染，提高植物对病原物的抗性。HIGS因其不依赖抗性品种资源而成为理想的植物病害防治策略(Koch,A.等.2014.Plant biotechnology journal.12:821-831)，已在部分植物-病原菌的互作系统中被成功应用。过去几年相关研究表明HIGS可以抑制植物病原菌的生长和致病，如应用于大麦上布氏白粉菌的防治(Nowara,D.等.2010.The plant cel.22(9):3130-3141)、小麦上条锈菌和镰刀菌的防治(Panwar,V.等.2013.Plant molecular biology.81(6):595-608；Koch,A.等.2014.Plant biotechnology journal.12:821-831)、水稻上稻瘟菌的防治(Zhang,D.等.2015.Plant science.237:24-32)以及棉花上大丽轮枝菌的防治(Duan C.G.等.2012.Silence.3(1):5)。Jahan等人针对致病疫霉4个与致病或细胞结构相关基因分别进行了转基因沉默植物的构建，发现表达靶向PiGPB1基因的发卡结构的植物抗病性明显增强，在该转基因植物叶片内鉴定到24-25nt的小RNA分子可以靶向PiGPB1基因，推测可引起转录后水平对靶基因的沉默(Jahan,S.N.等.2015,Journal of experimentalbotany.66(9):2785-2794)。以上研究说明基于HIGS的跨界基因沉默可有效用于植物病害防治。