[发明专利]适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法及其应用，该方法通过杂交探针的设计、探针预处理、样品杂交、连接反应、滚环扩增，仅需4轮连接测序即可解读上万种基因的原位空间转录表达谱。依据其探针设计特点又可应用于点突变以及甲基化位点原位检测。可实现单细胞、单分子、单碱基分辨的高通量基因原位解读。该方法的信号解读不依赖超分辨成像平台，推动了高通量原位空间转录组的普及和发展。

本发明是申请号为2020112910056的中国发明专利“适用于高通量转录组空间位置信息的检测方法及其应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及高通量原位杂交领域，具体涉及一种适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法及其应用。

背景技术

细胞学说的提出为科学家们对生命体的结构和功能以及其运转机制的研究奠定了基础。随着研究的深入，人们发现机体中同一组织来源的细胞也会存在基因组、表观基因组以及转录组上的差异；因此基于单细胞水平的研究尤为重要，应运而生的单细胞测序技术实现了在单个细胞水平上面对转录组或基因组进行扩增并测序。继人类基因组计划的浪潮之后人类细胞生物分子图谱计划(Human BioMolecular Atlas Program HuBMAP)和细胞图谱项目蓄势待发。

单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术让我们对细胞群的异质性、发育过程的动力学、疾病的发生发展以及细胞功能的调控机制都有了更深程度的理解。单个细胞是如何协调周围的多个细胞发挥功能仅仅依靠单个细胞的身份信息是远远不够的，需要借助新的方法来展示每个细胞的空间位置关系。运用生物信息学的方法对RNAseq数据中单个细胞的转录组进行聚类分析。由于细胞标记基因的相关位置信息有很大空白，因而此方法存在很大局限。另一方面，模式生物表达图谱以及艾伦脑科学研究所的小鼠和人类大脑图谱的广泛应用印证了空间转录组的前景价值。然而通过传统原位杂交或细胞特异性标签基因绘制的传统的图谱通量较低，无法解析复杂的环路及功能；近年有众多科学家通过原位杂交的方法对细胞的空间转录组进行成像，真实还原了细胞中转录组的表达状态。

目前主流的原位转录组学方法有基于单分子原位杂交的多重抗误差矫正荧光原位杂交技术(multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization,MERFISH)、序贯荧光原位杂交(sequential fluorescence in situ hybridization，seqFISH)、STARmap(Spatially-resolved Transcript Amplicon Readout Mapping。通过对多种不同的转录组进行迭代成像，从而将转录组的空间位置一一还原。由于每个转录本上只标记了32个荧光分子，该类方法的成像需要借助于超分辨荧光显微镜镜，成本高、技术要求高，因此很大程度上的限制了其广泛使用；此外这类方法目前都无法对基因的突变进行检测。

STARmap是一种基于原位测序的方法来展示空间转录组，运用锁式探针对转录本进行原位杂交，在锁式探针上针对不同转录本设计了相应的barcode，然后通过滚环扩增的方式对杂交的信号进行放大，最后通过连接测序的方式对barcode的序列逐轮进行解读，从而高通量的还原具有单细胞分辨率的转录组的空间位置信息。该方法的优势是信号强，可运用普通共聚焦进行成像，缺点是效率较低，易出现非特异性，也无法对基因的突变进行检测，只能检测转录本的有无。

原位转录组学在高精细神经环路解析、个体发育以及疾病发展等各项研究中有所应用，但目前的方法仍然存在下列问题：

1.基于单分子杂交的方法：

1)探针制备繁琐，成本高：针对每个基因需要设计24个以上的探针，虽以引物池的形式合成，但后续每个探针要经过PCR低循环扩增、纯化、转录、反转录、去RNA、再纯化等诸多过程。对于高通量多基因杂交工作量大。解读探针均需要氨基修饰，成本高。