[发明专利]适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法及其应用

权利要求书

1.一种适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，该方法用于非诊断目的检测，其特征在于：包括以下步骤：

1)杂交探针的设计

从待检测细胞或组织的RNA序列中筛选出杂交效率高、特异性强、无RNA高级结构的靶序列区域设计杂交探针，其中，所述杂交探针由锁式探针和RCA引发探针组成；其中，RNA序列的靶序列由3段连续的靶序列A、B和C组成，且所述锁式探针由5’端至3端’为A’序列，loop序列和B’序列，所述A’序列和B’序列分别与靶序列A、靶序列B互补，故所述锁式探针与靶序列互补配对后形成半闭合的环状结构；所述loop序列分别由anchor序列和barcode序列组成；所述loop序列的组成根据双barcode序列的测序方式不同，分为：

当barcode序列为双端测序时，与之对应的loop序列从5’端向3’端依次包括barcode1序列、mid-anchor序列和barcode2序列

其中，barcode1序列和barcode2序列的长度均为3-9bp，mid-anchor序列长度为15-30bp；

当barcode序列为单向双barcode测序，与之对应的loop序列从5’端向3’端依次包括barcode1序列、anchor-1序列、barcode2序列和anchor-2序列；

其中，barcode1序列和barcode2序列的长度均为3-9bp，anchor-1序列和anchor-2序列的长度为10-20bp；

2)探针预处理

对杂交探针中锁式探针的5’端进行磷酸化处理；

3)样品杂交

在待检测样本上制备一个反应腔室，用多聚甲醛对进行固定，然后用甲醇进行脱水和变性处理，再将含有杂交探针的缓冲液加入到反应腔室中过夜孵育；

4)连接反应

将连接酶反应体系加入到反应腔室中进行连接反应，使锁式探针与对应RNA上的靶序列互补配对形成半闭合的环状结构；

5)滚环扩增

RCA引发探针同时与RNA上的靶序列和锁式探针互补，Phi29DNA聚合酶以RCA引发探针为引物，以锁式探针的环状结构为模板进行滚环扩增，进一步放大信号；

6)barcode测序及数据分析，解读高通量转录组的空间信息：

a.将连接酶反应体系加入反应腔室中进行连接测序反应，然后对锁式探针中barcode的第一位碱基序列进行测序，按待检测样本特征对研究区域进行逐层成像扫描，叠加各层信号进行最大投影，注册解读每个荧光信号信息对应barcode信息；

b.同法依次解读锁式探针中barcode上的碱基序列信息；

c.对上述获得的3轮测序信息进行配准、barcode过滤、细胞分割；然后依次进行单细胞数据分析、基因的表达值进行表达矩阵的标准化和聚类分析，通过归一化和标准化处理对基因集进行降维聚类，根据不同细胞标记物对细胞群进行分类以及更细的亚分群，以确定特殊的细胞群，最终进行表达型的分析。

2.根据权利要求1所述适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述barcode序列分别由A、G、C、T随机排列组合而成。

3.根据权利要求2所述适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，其特征在于：进行双barcode测序时，对应的loop序列中，barcode1序列和barcode2序列每一位对应的碱基进行组合，其组合数为其中为从4种碱基中选出2个碱基进行组合，“4”为选出的2个碱基为同一种碱基的4种可能，则经过n轮测序后双barcode的组合数为10ⁿ。

4.根据权利要求1所述适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述RNA序列中，靶序列A、靶序列B和靶序列C长度均为11～16bp。

5.根据权利要求1所述适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述步骤2)中，磷酸化处理过程中，使用的酶为T4多聚核苷酸激酶T4 PNK。