[发明专利]代谢工程改造产溶剂梭菌及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及代谢工程改造产溶剂梭菌及其应用。本发明提供了编码α‑乙酰乳酸脱羧酶的基因过表达在燃料合成中的应用。本发明在产溶剂梭菌WK中搭建2,3‑丁二醇的生物合成途径，通过NADH补偿模块可以有效提升细胞内的还原力水平，也使丙酮和酸类等副产物产生水平显著降低，最终实现联合发酵2,3‑丁二醇、丁醇和乙醇的过程，进一步提升产物的高附加值性能。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及代谢工程改造产溶剂梭菌及其应用。

背景技术

在现代化高速发展的今天，工业生产与人民生活所涉及的各方面均需要大量能源的支持，而现阶段面临的主要窘境就是化石能源物质的开采与实现“碳中和”目标之间的矛盾，因此如何寻找和建立一种绿色、可持续的开发新能源的方式，以此来平衡能源需求与环境污染之间的关系是急需解决的重要问题。利用生物炼制技术，通过将可再生的生物质资源作为原料，以生物转化的方式来获取生物能源物质如2,3-丁二醇、丁醇、乙醇等的过程，具有高效、低成本且污染小等诸多优于化石能源的特点，已逐渐受到国内外企业的关注和推崇。

燃料乙醇在全球实施低碳减排的大背景下，已经成为了最主要的生物燃料之一。车用乙醇汽通过在汽油中加入一定比例的乙醇而形成的一种混合燃料，乙醇既可作为一种燃料，也是一种良好的汽油增氧剂，可大大降低汽车尾气中的有毒物质，起到净化空气的效果，因此在世界很多国家均作为汽车燃料来使用；相较于乙醇，生物丁醇具有低腐蚀性和高热能等方面的特性，在近几年也成为另一种极具潜力的新型生物燃料，世界各国也逐渐关注其工业化生产的进程；2,3-丁二醇作为在化工、食品、燃料、航空航天等多个领域具有广泛应用的重要化工原料，一方面因其高热值(27.2kJ/g)可直接作为燃料，也以燃料添加剂来增加燃料辛烷值，另一方面加工后可进一步生产包括甲乙酮、γ-丁内酯和1,3-丁二烯等关键下游产品，这些产品在全球市场销售额可达430亿美元，具有广阔的市场价值和潜力。

2,3-丁二醇的合成可以通过化学或生物的方式进行，但前者因石化原料的高涨和环境污染等受限，而后者主要可以通过肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)等微生物来进行，但由于这些菌株的致病性及其复杂的培养条件也限制其工业化应用的进程。因此，得益于现阶段基因大数据的爆发与合成生物学的发展，通过基因工程手段改造其他工业微生物可以实现2,3-丁二醇的生物合成，并进一步推进工业化应用。对于传统产溶剂梭菌而言，其发酵过程的主要副产物——丙酮不仅能占据总溶剂的20％～30％，也存在燃烧性能差且对发动机有腐蚀性等缺点。目前，已报道的大部分研究主要是通过抑制涉及丙酮合成基因(adc或ctfAB)的表达来降低或消除丙酮的产量，但是该过程容易引起其乙酸和丁酸积累并导致最终丁醇产量的降低。从另外的角度分析，通过碳代谢流的调控，将副产物进一步转化为其他高附加值的目标产物，以提升终端产品的价值，也是微生物代谢工程中一个非常重要的探索思路。目前现有技术存在的问题主要有：1)目前2,3-丁二醇的高产菌株主要是克雷伯氏菌、产气肠杆菌和粘质沙雷氏菌，这些菌株都具有潜在致病性，不符合工业化安全生产的要求；2)丙酮丁醇梭菌是一种极具潜力与竞争力的工业菌，其分子操作系统比较完善和成熟，但针对拜氏梭菌(C.beijerinckii)的转化过程，利用现有的转化方法效率较低；3)丙酮作为产溶剂梭菌发酵过程中的主要副产物之一，影响着生物转化效率。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了代谢工程改造产溶剂梭菌及其应用，本发明涉及的野生型产溶剂梭菌WK具有丁醇转化率高、副产物低且无需pH调控等特点，是一株具有工业应用潜力且安全的微生物菌株。本发明建立的基于产醇梭菌WK(属于拜氏梭菌)的高效且易操作的重组外源DNA的方法，将为后续开展该菌株及其同源菌株的遗传操作提供技术保证。通过降低丙酮所占比例或者将其转化为更具附加值的产品，将有利于提升效益的同时进一步降低纯化成本，因此本发明在于通过代谢途径改造，建立能够同时生产丁二醇、丁醇和乙醇这三种清洁燃料的工程菌株，为将廉价底物转化为多种高附加值产品提供数据支撑。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：