[发明专利]一种以工程化红细胞作为滋养层细胞体外高效扩增NK细胞的方法

说明书

一种以工程化红细胞作为滋养层细胞体外高效扩增NK细胞的方法，属于细胞基因治疗领域，包括使用低浓度戊二醛醛化红细胞表面蛋白，并在红细胞表面标记多种不同蛋白组合，包括IL‑15,4‑1BB，CD335单抗以及CD2单抗等，使用工程化红细胞作为滋养层细胞在体外反复刺激PBMC可以产生大量NK细胞，以工程化红细胞作为滋养层细胞体外高效扩增NK细胞具有如下优点：一、避免了K562等肿瘤细胞系的使用能够确保NK细胞制备过程更加安全，二、使用工程化红细胞反复刺激能够在体外获得大量高杀伤活性NK细胞，获得NK细胞数量比使用因子法能够增加30%以上。此种制备安全足量的NK细胞方法能够更加符合临床使用需求。

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其属于细胞基因治疗领域。

背景技术

自然杀伤细胞（Natural Killer Cell NK）细胞的主要特征是不需预先刺激就可直接溶解破坏肿瘤细胞和病毒感染细胞，通过分泌穿孔素、丝氨酸蛋白酶如颗粒酶A和B、硫酸软骨素蛋白聚糖等分子降解细胞膜、破坏靶细胞完整性而发挥溶细胞效应，其对不表达MHC分子的肿瘤细胞杀伤效果好，NK细胞在人外周血含量很少（5-10%），需要在体外大规模扩增NK细胞以为基础研究和临床应用研究使用NK细胞提供了一个有力的工具。目前使用得NK细胞体外大规模扩增方法可以分为“滋养层方法”和“因子法”，滋养层方法多采用以白血病细胞系K562细胞转入IL-15以及41-BB基因，细胞经过辐照后作为滋养层细胞用于NK细胞的培养。因子法以her-2单抗 IL-15 以及IL-12等方法在体外高效诱导NK细胞扩增。目前两种方法都存在一些问题影响了临床大规模NK细胞细胞推广应用。滋养层方法因为使用肿瘤细胞系K562细胞作为滋养层细胞，且细胞经过转基因处理，虽然处理后K562细胞失去扩增活性，但保留了分泌因子的能力，临床使用安全性方面需要经过更多的验证，另外，滋养层细胞的状态直接对NK细胞培养的效果有决定性的影响。因子法使用简单，但存在着受样本个体差异影响的问题，无法在所有样本中得到稳定一致的NK细胞扩增的得率和纯度。

发明内容

本发明提供一种以工程化红细胞作为滋养层细胞体外高效扩增NK细胞的方法，用以解决现有技术中的缺陷。

本发明通过以下技术方案予以实现：

一种用于体外高效扩增NK细胞的工程化红细胞滋养层细胞，其特征在于：使用红细胞表面修饰IL-15,4-1BB，CD335单抗以及 CD2单抗等蛋白形成工程化红细胞，工程化红细胞滋养层细胞可以用于反复刺激PBMC在体外获得大量高纯度NK细胞。

工程化红细胞表面修饰的蛋白组合有IL-15,4-1BB，CD335单抗以及 CD2单抗,其通过以下方法制得：

步骤一：新鲜红细胞使用0.025%戊二醛室温震荡作用45min；

步骤二：用PBS溶液300g 8min离心洗涤后分别用10μg/ml CD335单抗，10μg/mlIL-15、5μg/ml CD2单抗以及10μg/ml 4-1BB反应2小时；

步骤三：使用PBS溶液 300g 8min洗涤后获得工程化红细胞，工程化红细胞滋养层细胞保存于2-8°环境。

工程化红细胞滋养层细胞，可以用于反复刺激PBMC在体外获得大量高纯度NK细胞其具体使用方法如下：

步骤一：从脐血和外周血中获得单个核细胞，按工程化红细胞滋养层细胞/MNC 2：1的比例铺瓶培养；

步骤二：隔天补加新鲜培养液，培养第7天按工程化红细胞滋养层细胞/MNC 2：1的比例再次刺激所培养目的细胞；

步骤三：隔天补液，培养第14-15天收获目的细胞。