[发明专利]微生物单细胞全基因组扩增及测序文库构建方法

说明书

本发明提供一种微生物单细胞全基因组的扩增方法，至少包括如下步骤：(1)将微生物单细胞捕获于单一微腔室中，获得多个独立包含微生物单细胞的微腔室：(2)在包含微生物单细胞基因组及扩增反应体系的微腔室中，进行微生物单细胞全基因组扩增，获得包含微生物单细胞全基因组扩增产物。本发明中的微生物单细胞全基因组扩增方法将通过大幅压缩反应体系体积、提高反应体系内底物的相对浓度、隔绝外界以及交叉污染，提高微生物单细胞全基因组扩增质量和提高基因组测序覆盖率。本发明中，测序文库构建方法可大幅提高测序效率和基因组的测序覆盖率。

技术领域

本发明涉及单细胞测序领域，特别是涉及微生物单细胞全基因组扩增及测序文库构建方法。

背景技术

长期以来，因缺乏强有力的研究方法，微生物在很大程度上仍是一个黑箱。由于绝大多数微生物无法在现有实验条件下纯培养，对微生物组的发掘及研究主要依赖与宏基因组学方法。宏基因组学以环境样本中微生物群体基因组作为研究对象，本质上不具备单细胞的分辨率，无法获得单一物种的独立数据，而对于未知微生物的充分挖掘往往需要获取该种微生物的全基因组信息。因此，主流宏基因组学方法在研究较为稀有的微生物种群时捉襟见肘；开发高效的、具有微生物单细胞分辨率的微生物组研究方法，特别是大规模全基因组扩增及测序文库构建方法，对于推动微生物组学的研究具有重要价值。

近年来，高通量单细胞测序技术的飞速发展正逐渐将生命科学推向单细胞时代。单细胞转录组测序、甲基化测序等先进方法学的成功建立，使得科研人员能够在单细胞层面分析基因表达，表观遗传等信息。此类方法学主要依赖于高通量微流控技术(特别是微液滴技术)来高效地进行单细胞测序文库制备。然而，在微生物研究领域，单细胞分析并不普及，相关方法学的开发也较为困难。以全基因组扩增及测序文库构建为例，由于微生物基因组较小(Kbp-Mbp级别)，使用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)、多重置换扩增(Multiple displacement amplification,MDA)等方法并不能获得高质量的扩增产物，往往会伴随着高扩增偏倚和大量基因组片段丢失。此外，还存在着如何进行单基因组标记等测序文库制备的难题。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供微生物单细胞全基因组扩增及测序文库构建方法。

本发明第一方面提供一种微生物单细胞全基因组的扩增方法，至少包括如下步骤：

(1)将微生物单细胞捕获于单一微腔室中，获得多个独立包含微生物单细胞的微腔室：

(2)在包含微生物单细胞基因组及扩增反应体系的微腔室中，进行微生物单细胞全基因组扩增，获得包含微生物单细胞全基因组扩增产物。

本发明第二方面提供微生物单细胞全基因组的测序文库构建方法，包括如下步骤：

A.将前述微生物单细胞全基因组的扩增方法获得的包含微生物单细胞全基因组扩增产物的微腔室中的扩增产物片段化，获得包含片段化扩增产物的微腔室；

B.将步骤A获得的微腔室中的片段化扩增产物与条形码片段在单一微腔室中连接，获得微生物单细胞全基因组的测序文库，所述测序文库中，所述微生物单细胞全基因组处于微腔室中，且每个微腔室中有且仅有单一微生物单细胞全基因组。

如上所述，本发明的微生物单细胞全基因组扩增及测序文库构建方法，具有以下有益效果：

a.本项发明将可为探索微生物暗物质提供新的重要方法。

b.本发明中的微生物单细胞全基因组扩增方法将通过大幅压缩反应体系体积、提高反应体系内底物的相对浓度、隔绝外界以及交叉污染，提高微生物单细胞全基因组扩增质量和提高基因组测序覆盖率。