[发明专利]微生物单细胞全基因组扩增及测序文库构建方法

权利要求书

1.一种微生物单细胞全基因组的扩增方法，至少包括如下步骤：

(1)将微生物单细胞捕获于单一微腔室中，获得多个独立包含微生物单细胞的微腔室：

(2)在包含微生物单细胞基因组及扩增反应体系的微腔室中，进行微生物单细胞全基因组扩增，获得包含微生物单细胞全基因组扩增产物。

2.如权利要求1所述的微生物单细胞全基因组的扩增方法，其特征在于，步骤(2)中，所述形成包含微生物单细胞基因组及扩增反应体系的微腔室的方式选自以下任一：

I.对单一微腔室中所包含的微生物单细胞进行原位裂解，获得包含有微生物单细胞的基因组的微腔室，将扩增体系加入含有微生物单细胞基因组的微腔室中，形成所述包含微生物单细胞基因组及扩增反应体系的微腔室；

II.在所述包含微生物单细胞的微腔室内加入扩增反应体系，形成所述包含微生物单细胞及扩增反应体系的微腔室，在所述微腔室内进行对微生物单细胞进行原位裂解和扩增，形成所述包含微生物单细胞基因组及扩增反应体系的微腔室。

3.如权利要求2所述的微生物单细胞的扩增方法，其特征在于，方式I中，所述裂解方法选自酶裂解，碱裂解，热休克裂解或超声波裂解。

4.如权利要求1所述的微生物单细胞全基因组的扩增方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

1)所述微腔室的形式选自微液滴、微球、半透膜体系、脂质体体系、微孔板或离心管；

2)所述微腔室的体积大小为皮升至纳升数量级；

3)所述微腔室内含有微腔室基质，所述微腔室基质选自聚丙烯酰胺、聚乙二醇或琼脂糖；

4)步骤(2)中，所述扩增方法选自PCR、MDA、MALBAC或LIANTI。

5)步骤(2)中，所述扩增引物选自随机引物或区域特异性引物。

5.一种微生物单细胞全基因组的测序文库构建方法，包括如下步骤：

A.将权利要求1-4任一所述微生物单细胞全基因组的扩增方法获得的包含微生物单细胞全基因组扩增产物的微腔室中的扩增产物片段化，获得包含片段化扩增产物的微腔室；

B.将步骤A获得的微腔室中的片段化扩增产物与条形码片段在单一微腔室中连接，获得微生物单细胞全基因组的测序文库，所述测序文库中，所述微生物单细胞全基因组处于微腔室中，且每个微腔室中有且仅有单一微生物单细胞全基因组。

6.如权利要求5所述的微生物单细胞全基因组的测序文库构建方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

1)所述微腔室的形式选自微液滴、微球、半透膜体系、脂质体体系、微孔板或离心管；

2)所述微腔室的体积大小为皮升至纳升数量级；

2)所述微腔室内含有微腔室基质，所述微腔室基质选自聚丙烯酰胺、聚乙二醇或琼脂糖。

7.如权利要求5所述的微生物单细胞全基因组的测序文库构建方法，其特征在于，包含片段化扩增产物的微腔室中采用如下方法获得：使所述的微生物单细胞全基因组扩增产物的微腔室中包含有水凝胶组分，在适宜凝固的条件下，进行凝固，获得包含微生物单细胞全基因组扩增产物的水凝胶微腔室；将包含微生物单细胞全基因组扩增产物的水凝胶微腔室与片段化反应体系融合，获得包含片段化扩增产物的水凝胶微腔室。

8.如权利要求5所述的微生物单细胞全基因组的测序文库构建方法，其特征在于，步骤A中，片段化的方法选自以下任一项：超声波打断、离心剪切或酶切。

9.如权利要求8所述的微生物单细胞全基因组的测序文库构建方法，其特征在于，所述酶切法采用的酶选自dsDNA Fragmentase或转座酶。

10.如权利要求5所述的微生物单细胞全基因组的测序文库构建方法，其特征在于，步骤B中，将包含片段化扩增产物的微腔室与包含条形码序列的微球、扩增反应体系或连接酶反应体系或杂交反应体系共包埋于同一微腔室中，使包含条形码序列的微球上的条形码脱落，进行扩增或连接或杂交反应，使所述片段化扩增产物与条形码片段连接。