[发明专利]一种利用酚氯仿法纯化RNA的方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种利用酚氯仿法纯化RNA的方法，通过酚氯仿法优化实验步骤，通过变性作用抑制RNaseA和DNaseI活性，除去RNaseA和DNaseI后获得纯化的RNA双链。具体包括：利用Trizol试剂提取总RNA；添加DNaseI试剂去除基因组DNA；在反应体系中加入RNaseA去除单链RNA；利用酚氯仿法纯化dsRNA；对dsRNA进行反转录反应；设计特异性引物并进行PCR扩增；琼脂糖凝胶电泳。本发明通过酚氯仿法优化实验步骤，通过变性作用抑制RNaseA和DNaseI活性，避免反转录和RT‑PCR过程中RNA降解、cDNA/DNA产物降解的影响。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种利用酚氯仿法纯化RNA的方法。

背景技术

目前，在生物体中，反义长链非编码RNA(Antisense long non-coding RNA，ASlncRNA)可以通过碱基互补配对与正义基因的mRNA结合形成互补双链，掩盖掉mRNA的分子作用位点，从而防止mRNA被小RNA或者其他核糖核酸酶降解，增加mRNA的稳定性。通过核糖核酸酶保护实验验证AS lncRNA与正义基因的mRNA是否形成双链核糖核酸(Double-stranded RNA，dsRNA)相互作用是广泛使用的一种方法。

但是，传统RPA未对实验中用到的RNaseA和DNase I进行处理，这会对后续的反转录和RT-PCR产生一定程度影响并导致实验误差。因此，亟需设计一种新的纯化RNA的方法。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：传统RPA未对实验中的RNaseA和DNase I进行处理，影响后续的反转录和RT-PCR，并导致实验误差。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用酚氯仿法纯化RNA的方法，尤其涉及一种核糖核酸酶保护实验的优化方法。

本发明是这样实现的，一种利用酚氯仿法纯化RNA的方法，所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法包括：

通过酚氯仿法优化实验步骤，通过变性作用抑制RNaseA和DNase I活性，除去RNaseA和DNase I后获得纯化的RNA双链。

进一步，所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法包括以下步骤：

步骤一，利用Trizol试剂提取总RNA；

步骤二，通过添加DNase I试剂去除基因组DNA；

步骤三，在反应体系中加入RNaseA去除单链RNA；

步骤四，利用酚氯仿法纯化dsRNA；

步骤五，对纯化的dsRNA进行反转录反应；

步骤六，设计特异性引物并进行PCR扩增；

步骤七，进行琼脂糖凝胶电泳。

进一步，所述步骤一中的提取总RNA包括：

利用Trizol试剂进行总RNA提取，对获得的RNA进行质量分析和浓度检测，选择质量合格的样品进行后续分析。

进一步，所述步骤二中的去除基因组DNA包括：

通过添加1μL DNase I试剂去除RNA样品中的基因组DNA，在37℃下反应30min。

所述步骤三中的去除单链RNA包括：

向步骤二的反应体系中加入2μL RNase A去除反应体系中的单链RNA，将反应体系在37℃下反应60min。

进一步，所述DNase I的浓度为3units/μL，所述RNase A的浓度为20μg/μL。