[发明专利]一种利用酚氯仿法纯化RNA的方法

权利要求书

1.一种利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法包括：通过酚氯仿法优化实验步骤，通过变性作用抑制RNase A和DNase I活性，除去RNaseA和DNase I后获得纯化的RNA双链。

2.如权利要求1所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法包括以下步骤：

步骤一，利用Trizol试剂提取总RNA；

步骤二，通过添加DNase I试剂去除基因组DNA；

步骤三，在反应体系中加入RNaseA去除单链RNA；

步骤四，利用酚氯仿法纯化dsRNA；

步骤五，对纯化的dsRNA进行反转录反应；

步骤六，设计特异性引物并进行PCR扩增；

步骤七，进行琼脂糖凝胶电泳。

3.如权利要求2所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述步骤一中的提取总RNA包括：

利用Trizol试剂进行总RNA提取，对获得的RNA进行质量分析和浓度检测，选择质量合格的样品进行后续分析。

4.如权利要求2所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述所述步骤二中的去除基因组DNA包括：

通过添加1μL DNase I试剂去除RNA样品中的基因组DNA，在37℃下反应30min；

所述步骤三中的去除单链RNA包括：

向步骤二的反应体系中加入2μL RNase A去除反应体系中的单链RNA，将反应体系在37℃下反应60min。

5.如权利要求4所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述所述DNase I的浓度为3units/μL，所述RNase A的浓度为20μg/μL。

6.如权利要求2所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述所述步骤四中的纯化dsRNA包括：

(1)对反应产物通过酚氯仿法进行RNA的纯化；加入200μL氯仿试剂，上下震荡15s，而后室温静置3min；

(2)12000g，4℃，离心15min，离心后溶液分为可见的二层，吸取上层无色水相到新的离心管；

(3)每管加入500μL异丙醇试剂，颠倒混匀后，室温静置10min；

(4)12000g，4℃，离心10min，离心后管底出现少量絮状沉淀，弃上清；

(5)加入1mL 75％乙醇溶液，轻轻颠倒混匀后，7500g，4℃，离心5min，离心后弃上清，并在冰上干燥5～10min；

(6)向RNA沉淀中加入30μL RNase Free水，用移液枪轻轻吹打混匀。

7.如权利要求2所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述所述步骤五中的dsRNA反转录包括：

基于All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR，对纯化的RNA产物进行反转录反应。

8.如权利要求2所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述所述步骤六中的设计特异性引物并进行PCR扩增包括：

利用Primer 5.0软件针对AS lncRNA与正义基因的互补与非互补重叠区域分别设计特异性引物；通过High Fidelity PCR SuperMix分别对互补与非互补重叠的区域进行PCR扩增，按94℃预变性3min，重复35个循环，72℃5min终止延伸的反应条件进行。

9.如权利要求8所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述所述PCR扩增条件为：94℃变性30sec，50～60℃退火30sec，72℃延伸1min。

10.如权利要求2所述利用酚氯仿法纯化RNA的方法，其特征在于，所述所述步骤七中的琼脂糖凝胶电泳包括：

制作2％的琼脂糖凝胶，将PCR产物加到点胶孔，在120V电压环境下跑胶进行产物的检测，并在Bio-rad凝胶成像分析系统拍照记录。