[发明专利]一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒

说明书

本发明涉及一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，选用差速离心和超滤离心相结合，增加稀释和超滤浓缩步骤分离纯化外泌体，以大幅度提高其纯度且减少外泌体的损耗。还包括该试剂盒胃癌诊断中的应用。本发明与现有技术相比，获得大量高纯度稳定的外泌体，平均尺寸为30‑150 nm，完整的茶杯托样结构，粒径分布均匀，且表面携带标志性蛋白CD9、CD81、CD63，克服了现有制备技术存在纯度低，产量低，表征蛋白表达量低等不足，本发明获得的外泌体可以直接用于后续的检测，安全系数高，不会引起外泌体功能的缺失，既可以用于科学研究，又可以用于外泌体中标志物如miRNA的检测，可用于筛查与诊断早期胃癌。

技术领域

本发明属于纳米生物技术领域，具体涉及一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒。

背景技术

外泌体（exosome）是由很多类型细胞分泌的30-150 nm的“杯托状”磷脂双分子层囊泡，密度为1.13-1.19 g/mL，携带多种蛋白质、脂质和核酸，功能复杂，参与免疫调节、调控细胞外基质重构、激活细胞的信号通路等。分离出的外泌体，进行进一步检测肿瘤标志物，如miRNA, 可以用于肿瘤的筛查及早期诊断。到目前为止，外泌体分离的方法已有一些报道，但存在一些问题，传统的超速离心得到的外泌体纯度尚可，但其产量不高；根据外泌体尺寸原理设计的超滤，透析等方法又不能很好的去除与外泌体尺寸一致的杂蛋白；而采用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）沉淀法和免疫磁珠法都不同程度地引入不适合临床治疗的外源性物质。研发新型的高纯度外泌体分离试剂盒，具有巨大的临床需求。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，以产生大量临床级高纯度外泌体。

进一步的，本发明再一目的在于，提供一种上述试剂盒的应用。

本发明目的通过以下技术方案来实现：一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，选用差速离心和超滤离心相结合，增加稀释和超滤浓缩步骤分离纯化外泌体，以大幅度提高其纯度且减少外泌体的损耗，包括以下步骤：

（1）收集患者的血液样本至少2ml, 离心分离出上清，转移到另一个离心管中，用4℃条件下磷酸盐缓冲液对收集的上清液进行稀释,得稀释液；和/或

收集患者的尿液样本至少2ml, 离心分离出上清，转移到另一个离心管中，采用4℃条件下磷酸盐缓冲液对收集的上清液进行稀释,得稀释液；

（2）将步骤（1）制得的稀释液在4℃条件下以2000-3000 rpm的转速离心，留取上清液，弃沉淀；

（3） 将步骤（2）得到的上清液在4℃条件下以8000-12000 rpm的转速离心，留取上清液，弃沉淀；

（4）用4℃条件下磷酸盐缓冲液稀释步骤（3）中得到的上清液的，继续用100 kDa-150 kDa超滤管以3000-4000 rpm的速度离心10min，去除小分子杂质的同时得到浓缩上清液，以减少接下来的超速离心工作量及成本；

（5）将步骤（4）得到的浓缩上清液以4℃条件下8000 g 的转速离心60 min，离心结束后，弃上清，保留沉淀；

（6）将步骤（5）得到的沉淀用磷酸盐缓冲液重悬转移至透析袋中，透析3h即可得到所需的高纯度血清或尿液中外泌体的目标液。

其中，所述的磷酸盐缓冲液配方：KCL 200 mg/L；NaCL 8g/L；KH₂PO₄ 240 mg/L；Na₂HPO₄ 1.44 g/L。

在上述方案基础上，所述步骤（1）中磷酸盐缓冲液与上清的稀释体积比是1：1。

进一步的，所述步骤(2)中离心时间为8-10 min；步骤(3)中离心时间为15-25min。