[发明专利]一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒

权利要求书

1. 一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，其特征在于，选用差速离心和超滤离心相结合，增加稀释和超滤浓缩步骤分离纯化外泌体，以大幅度提高其纯度且减少外泌体的损耗，包括以下步骤：

（1）收集患者的血液样本至少2ml, 离心分离出上清，转移到另一个离心管中，用4 ℃条件下磷酸盐缓冲液对收集的上清液进行稀释,得稀释液；和/或

收集患者的尿液样本至少2ml, 离心分离出上清，转移到另一个离心管中，采用4℃条件下磷酸盐缓冲液对收集的上清液进行稀释,得稀释液；

（2）将步骤（1）制得的稀释液在4℃条件下以2000-3000 rpm的转速离心，留取上清液，弃沉淀；

（3） 将步骤（2）得到的上清液在4℃条件下以8000-12000 rpm的转速离心，留取上清液，弃沉淀；

（4）用4℃条件下磷酸盐缓冲液稀释步骤（3）中得到的上清液的，继续用100 kDa-150kDa超滤管以3000-4000 rpm的速度离心5-10min，去除小分子杂质的同时得到浓缩上清液，以减少接下来的超速离心工作量及成本；

（5）将步骤（4）得到的浓缩上清液以4℃条件下8000 -100,000g 的转速离心60 min，离心结束后，弃上清，保留沉淀；

（6）将步骤（5）得到的沉淀用磷酸盐缓冲液重悬转移至透析袋中，透析3h即可得到所需的高纯度血清或尿液中外泌体的目标液。

2. 根据权利要求1所述的一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液配方：KCL 200 mg/L；NaCL 8g/L；KH₂PO₄ 240 mg/L；Na₂HPO₄1.44 g/L。

3.根据权利要求1或2所述的一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，其特征在于，所述步骤（1）中磷酸盐缓冲液与上清的稀释体积比是1：1。

4. 根据权利要求1所述的一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，其特征在于，所述步骤(2)中离心时间为8-10 min；述步骤(3)中离心时间为15-25 min。

5.根据权利要求1或2所述的一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，其特征在于，步骤（6）中采用1 mL-4 mL磷酸盐缓冲液重悬转移至透析袋中，透析袋孔径是30 nm-35 nm，磷酸盐缓冲液作为透析液，透析3-8h即可得到所需的高纯度血清或尿液中外泌体的目标液。

6.根据权利要求1或2所述的一种临床级高纯度血液或尿液中外泌体分离纯化试剂盒，其特征在于，按以下步骤：

（1）采集胃癌患者的血液样本2ml, 离心分离出上清，转移到另一个离心管中，4℃条件下用磷酸盐缓冲液对收集的上清液进行稀释,得稀释液；

（2）将步骤（1）制得的稀释液在4℃条件下以3000 rpm的转速离心8 min，沉淀为细胞，留取上清液，弃沉淀；

（3） 将步骤（2）得到的上清液在4℃条件下以9000 rpm的转速离心15min，留取上清液，弃沉淀；

（4）用4℃条件下磷酸盐缓冲液稀释步骤（3）中得到的上清液的，继续用110 kDa超滤管以3000-4000 rpm的速度离心5min，去除小分子杂质的同时得到浓缩上清液，以减少接下来的超速离心工作量及成本；

（5）将步骤（4）得到的浓缩上清液以4℃条件下100,000g的转速离心60 min，离心结束后，弃上清，保留沉淀；

（6）将步骤（5）得到的沉淀用磷酸盐缓冲液重悬转移至透析袋中，透析8h即可得到所需的高纯度大量的外泌体的目标液。