[发明专利]一种土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法

说明书

本发明提供了一种土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法，包括：1)取土壤或底泥样品放入离心管中，称量离心管取样前后的重量，得到样品净重后，向离心管中加入Percoll溶液；2)轻微震荡后将离心管放入超声波清洗仪；3)待超声波清洗仪工作完成后取出离心管，放入离心机；4)待离心机运转完毕后取出离心管，轻微震荡后用滤网过滤上清液，取部分上清液至流式细胞管并运行流式细胞仪，利用流式细胞仪对上清液中的藻细胞进行藻种和藻密度的检测与统计分析，得出所需藻细胞种类与数量。本发明无需通过分离培养与分子分析技术，即可获得原生环境藻类群落的完整信息，具有成本低廉、操作简便、可重复性强、可直接快速分析等优点。

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种土壤/底泥活体藻细胞分离提取与快速分类计数方法。

背景技术

藻细胞广泛分布于自然界，包括各种水体、土壤和其他环境中，底泥藻类是生态系统的物质循环和能量流动不可或缺的角色，部分藻种越冬休眠时会集中在底泥内，此时的藻细胞起到“种源”作用，待来年升温时底泥中的“种源”藻类会不断释放至水体中，易导致来年出现水华爆发等现象，直接或间接地影响水生生物生存及生态系统安全。掌握底泥中活体藻细胞的种类和数量，是开展藻类水华形成机理研究和水华防治技术研究工作开展的基础。

通常藻类生物量的统计方法有显微镜血球计数法、光合色素含量测定法、光密度值法及其他创新方法：

1)显微镜血球计数法采样及运输量大、沉降浓缩耗时长，需要科研人员连续观察多个视野，计数容易重复或遗漏，准确率、效率较低，对水平和经验要求较高；由于土壤/底泥中存在大量杂质，因此存在藻细胞镜检观察困难、计数难度大的问题。除镜检计数法外，诸如基于双向背景差分法的成像流式细胞粘连计数方法(王俊生,张红月.一种基于双向背景差分法的成像流式细胞粘连计数与活性检测方法、装置[P].辽宁省：CN113222969A,2021-08-06.)、基于线扫描拉曼显微成像的藻细胞计数及藻种判别方法(何石轩,谢婉谊,方绍熙,王德强.基于线扫描拉曼显微成像的藻细胞计数及藻种判别方法[P].重庆市：CN106442463B,2019-03-08.)等创新方法，对藻细胞的计数都会受到泥沙干扰。

2)光合色素含量测定法需经过抽滤、研磨、萃取、离心、比色测定等步骤，操作复杂，耗时长、效率低；该方法对藻生物量的统计可能受无活性的破损或死亡藻细胞及残留光合色素影响，无法准确统计土壤/底泥中具有活性的藻细胞数量；进行提取溶剂多为甲醇、乙醇、丙酮等对人体有毒害的有机溶剂。

3)光合色素在操作过程中易分解，容易产生误差；无法判定浮游植物的种类。光密度值法(苏文,孔繁翔,赵旭辉.一种铜绿微囊藻的快速计数方法[P].江苏：CN103276045A,2013-09-04.)适用于已知藻种的室内模拟实验，无法对藻类进行鉴定；泥土中提取藻类时携带部分泥沙，对紫外分光光度计数据有较大干扰，故此方法只能运用于水体中藻密度的检测。

土壤/底泥中的活体藻细胞难以统计的重要原因之一是活体藻细胞较难从土壤/底泥中进行充分分离。张呈祥等提出了一种通过超声波清洗原理将藻细胞从沉水植物等附着基质上分离，使藻细胞进入蒸馏水形成藻液并统计的方法(张呈祥,雷光春,裴洪翠.附着藻类分离取样装置、附着藻类含量计算系统及方法[P].北京市：CN111537678A,2020-08-14.)。该方法及其装置需使用抽滤装置，经室内实验尝试后发现此方法对土壤/底泥无法适用，大量泥沙堆积不仅容易堵塞滤膜与装置，更会使藻细胞在大压强作用下被破坏。

针对土壤/底泥中藻细胞的计数，目前使用的方法如下：

1)取一定量混匀的土壤/底泥样品，加入Percoll悬浮液与甲醛混合溶液，静置后用倒置荧光显微镜进行镜检分类并计数(邹万生,王智,刘良国,王文彬,石迎普.冲天湖底泥表层微囊藻休眠体复苏与菌群动态[J].生态学报,2017,37(19):6597-6606.)。该方法向样品中加入了甲醛溶液，使得藻细胞丧失活性，无法对藻细胞开展与生理生态特征相关的后续研究。