[发明专利]基于RPA-LbCas12a体系可视化检测类鼻疽的组合物及其应用

说明书

本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及一种基于RPA‑LbCas12a体系可视化检测类鼻疽的组合物及其应用。本发明提供用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物，包括RPA引物、crRNA、LbCas12a蛋白酶和ssDNA荧光探针；所述RPA引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；所述crRNA的转录模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所示。基于所述组合物，本发明还提供一种检测类鼻疽伯克霍尔德菌的方法。该方法通过RPA扩增与CRISPR‑Cas12a系统的结合，获得了检测下限为2.7拷贝/μL的灵敏度以及更强的特异性，并且能在1h内检出样本中是否含有类鼻疽伯克霍尔德菌，无需借助大型仪器设备，有助于类鼻疽的快速诊断和筛查。

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及一种基于RPA-LbCas12a体系可视化检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物及其应用。

背景技术

类鼻疽(Melioidosis)是由类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,Bp)经呼吸道气溶胶或皮肤破溃接触等途径感染所致的疾病，其自然疫源地为我国海南与东南沿海等亚热带地区。随着近年来人口流动增加，非自然疫源地也相继发生输入性病例。目前BP感染尚无有效治疗方案，无疫苗防护；Bp易获取、易传播、耐药广，被列入国际“生物武器公约”核查清单、美国CDC I类生物恐怖剂；感染临床表现“隐匿”或“似百样病”。若不及时治疗，极易发展为脏器脓肿甚至败血症，临床死亡率10％～60％。因此，针对类鼻疽的快速诊断极为重要。

目前类鼻疽的实验室诊断方法主要包括：细菌分离培养、血清学检测、蛋白质组学分析以及分子生物学方法等。分离培养虽然是感染诊断的金标准，但是耗费周期长，易错过最佳诊疗时机，并且在没有相关经验时容易误鉴定为污染或同种属的其他细菌，导致错误治疗，延误患者病情；血清学检测由于窗口期以及疫区人群背景干扰(海南当地人群血清抗体阳性率6％～20％)，极易造成血清学检测假阴性或假阳性结果；基于蛋白质组学分析的细菌质谱鉴定对细菌样本的浓度和纯度有所要求，且由于地域差异和数据库更新滞后等原因导致某些菌种的检测结果不稳定；目前已报道的分子生物学方法主要是基于PCR方法以及Lamp(环介导的等温扩增)，检测靶基因包括16s rRNA以及III型和VI型分泌系统基因簇等，类鼻疽伯克霍尔德菌与泰国伯克霍尔德菌和鼻疽伯克霍尔德菌的16s rRNA序列差异较小，极易导致鉴定错误；PCR方法在仪器条件、人员操作等方面要求较高，不适用于床旁快速诊断(野外快速检测)；并且Lamp方法容易形成气溶胶污染，导致假阳性结果。因此，亟需提供一种快速、灵敏、特异的类鼻疽检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物，以满足对类鼻疽伯克霍尔德菌感染进行快速、准确诊断的需求，能有效避免漏检和误检。

本发明提供的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物，其特征在于，包括RPA引物、crRNA、LbCas12a蛋白酶和ssDNA荧光探针；所述RPA引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；所述crRNA的转录模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所示。

所述ssDNA荧光探针的序列可以是TTATT，其5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记BHQ1淬灭基团。

所述组合物还可以包括重组酶聚合酶恒温扩增(RPA)反应体系所需的通用试剂和/或CRISPR-Cas12a切割体系所需的通用试剂。

任一所述的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物在制备用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂盒，其特征在于，包括任一所述的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物。