[发明专利]基于RPA-LbCas12a体系可视化检测类鼻疽的组合物及其应用

权利要求书

1.用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物，其特征在于，包括RPA引物、crRNA、LbCas12a蛋白酶和ssDNA荧光探针；所述RPA引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示；所述crRNA的转录模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所示。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述ssDNA荧光探针的序列为TTATT，其5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记BHQ1淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括重组酶聚合酶恒温扩增(RPA)反应体系所需的通用试剂和/或CRISPR-Cas12a切割体系所需的通用试剂。

4.权利要求1-3任一所述的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物在制备用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用。

5.用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物。

6.权利要求1-3任一所述的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物或权利要求5所述的试剂盒在类鼻疽伯克霍尔德菌检测中的应用。

7.一种检测类鼻疽伯克霍尔德菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取待测样品的基因组DNA；

S2.以待测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1中所述的RPA引物进行重组酶聚合酶恒温扩增反应，得到RPA产物；

S3.将权利要求1中所述的crRNA、LbCas12a蛋白酶和ssDNA荧光探针与步骤S2得到的RPA产物混合后进行CRISPR-Cas12a切割反应，得到酶切产物；

S4.对步骤S3得到的酶切产物进行荧光信号检测；若酶切产物产生荧光，则判断待测样品中含有类鼻疽伯克霍尔德菌；若酶切产物无荧光产生，则判断待测样品中不含有类鼻疽伯克霍尔德菌。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光信号检测的方法为如下a)或b)：

a)将所述酶切产物置于LED蓝光下，裸眼观察酶切产物是否有荧光产生；

b)将所述酶切产物置于荧光定量仪中检测荧光强度；若相对荧光单位高于659，则判断待测样品中含有类鼻疽伯克霍尔德菌；若相对荧光单位低于659，则判断待测样品中不含有类鼻疽伯克霍尔德菌。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶恒温扩增反应的体系和条件为：Rehydration Buffer 29.5μL，基因组DNA 5μL，10μM RPA正反向引物各2.4μL，RNase-free ddH₂O 8.2μL，混匀后加入280mM MgOAc 2.5μL启动反应，于39℃反应20min。

10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas12a切割反应的体系和条件为：RNase free ddH₂O 5.2μL，DNase I Reaction Buffer 2μL，1.34μg/μLLbCas12a 1μL，1.67μg/μL crRNA 0.8μL，10μM ssDNA荧光探针1μL，RPA产物10μL，混匀后置于37℃反应30min。