[发明专利]Heg1基因点突变小鼠模型、其构建方法及应用

说明书

本申请具体涉及Heg1基因点突变小鼠模型、其构建方法及应用。该构建方法包括：S1、构建Heg1基因点突变敲入的打靶载体；S2、经过质粒提取和线性化后，将打靶载体转染至ES细胞；S3、筛选鉴定阳性ES细胞，获得正确同源重组的阳性克隆，再将克隆的阳性ES细胞注入供体小鼠的囊胚中，获得嵌合鼠；S4、将嵌合鼠与Flp小鼠交配得到F1代小鼠，筛选得到去除打靶载体中的Neo的F1代杂合子小鼠；S5、将F1代杂合子小鼠进行自交得到F2代小鼠，筛选得到隐性纯和突变小鼠即为Heg1基因点突变小鼠模型。本申请实施例的技术方案能够应用于颅缝早闭综合征相关预防、治疗或诊断药物的研发，在颅缝早闭手术、先天性心脏病救治的致病机理、治疗方法、药物筛选等方面有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种Heg1基因点突变小鼠模型、其构建方法及应用。

背景技术

先天性颅缝早闭症是颅骨一个或多个颅缝发生过早的骨性融合，颅缝旁的颅骨及脑组织生长受限，导致颅腔和眶腔狭小、颅内高压、颅颌面畸形的疾病。颅缝早闭症是最常见的先天性颅颌面畸形之一，新生儿中发病率为0.03％～0.05％，居常见颅面发育畸形发病率的第2位(约为1/2000，仅次于唇腭裂畸形)。颅缝早闭发生于胚胎期，出生后随着年龄增长逐渐加重。颅缝早闭不仅造成颅面骨骼发育异常，更严重的是使患儿的大脑发育受到限制。对于先天性颅缝早闭症的早期诊断、早期治疗，保障大脑生长发育及视觉功能等显得尤为重要。

Heg1基因的首次发现是在进行ENU诱导的斑马鱼大规模突变及性状筛选的过程之中，该基因突变缺失后的斑马鱼及小鼠均表现出心脏腔室的异常扩张及腺体的膨大。HEG1蛋白属于具有一次跨膜结构域的受体分子，具有高度保守的胞内段结构域，其蛋白C端被证实可以与CCM1、RASIP1等分子相结合，继而与下游其他蛋白进行连接作用。目前尚未发现与Heg1基因有关的颅缝早闭合并先天性心脏病综合征的报道，相应的治疗方法也未展开过系统研究。

基于上述情况，特提出本申请。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Heg1基因点突变小鼠模型、其构建方法及应用，能够应用于颅缝早闭综合征相关预防、治疗或诊断药物的研发，在颅缝早闭手术、先天性心脏病救治的致病机理、治疗方法、药物筛选等方面有重要意义。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

第一方面，提供一种Heg1基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括：

S1、构建Heg1基因点突变的打靶载体；

S2、经过质粒提取和线性化后，将所述打靶载体转染至ES细胞；

S3、筛选鉴定阳性ES细胞，获得正确同源重组的阳性克隆，再将克隆的阳性ES细胞注入供体小鼠的囊胚中，获得嵌合鼠；

S4、将嵌合鼠与Flp小鼠交配得到F1代小鼠，筛选得到去除打靶载体中的Neo的F1代杂合子小鼠；

S5、将F1代杂合子小鼠进行自交得到F2代小鼠，筛选得到隐性纯和突变小鼠即为Heg1基因点突变小鼠模型。

在一些可能的实施方式中，步骤S1中，所述构建Heg1基因点突变的打靶载体包括：

在所述Heg1基因上选择待突变的靶位点，根据所述靶位点的外显子序列，设计并构造对应所述靶位点的打靶载体序列。

在一些可能的实施方式中，所述靶位点为c.73_74insTGA；和/或，所述打靶载体包括1.0kb 5’同源臂、PM区域、PGK-Neo-polyA、2.4kb 3’同源臂和MC1-TK-polyA负筛选标记。

在一些可能的实施方式中，步骤S2中，所述线性化包括：

在所述打靶载体中插入酶切位点，调节酶切位点控制同源臂序列长度，将载体酶切后进行胶回收。