[发明专利]Heg1基因点突变小鼠模型、其构建方法及应用

权利要求书

1.Heg1基因点突变小鼠模型的构建方法或Heg1基因点突变小鼠模型或其子代在不以疾病的诊断和治疗为目的的颅缝早闭综合征相关领域的应用，其特征在于，所述Heg1基因点突变为c.73_74insTGA。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括在制备或筛选预防、诊断或者治疗颅缝早闭综合征及相关并发症药物的用途。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述构建方法包括：

S1、构建Heg1基因点突变敲入的打靶载体；

S2、经过质粒提取和线性化后，将所述打靶载体转染至ES细胞；

S3、筛选鉴定阳性ES细胞，获得正确同源重组的阳性克隆，再将阳性ES细胞克隆注入供体小鼠的囊胚中，获得嵌合鼠；

S4、将所述嵌合鼠与Flp小鼠交配得到F1代小鼠，筛选得到去除打靶载体中的Neo的F1代杂合子小鼠；

S5、将所述F1代杂合子小鼠进行自交得到F2代小鼠，筛选得到隐性纯和突变小鼠即为Heg1基因点突变小鼠模型。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤S1中，所述构建Heg1基因点突变的打靶载体包括：

在所述Heg1基因上选择待突变的靶位点，根据所述靶位点的外显子序列，设计并构造对应所述靶位点的打靶载体序列。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述打靶载体包括1.0kb 5’同源臂、PM区域、PGK-Neo-polyA、2.4kb 3’同源臂和MC1-TK-polyA负筛选标记。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤S2中，所述线性化包括：

在所述打靶载体中插入酶切位点，调节酶切位点控制同源臂序列长度，将载体酶切后进行胶回收。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤S3中，所述筛选鉴定阳性ES细胞包括：

以长片段PCR方式检测Heg1 Knock-In细胞阳性突变克隆株，所使用的引物的碱基序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤S4中，还包括：

对F1代小鼠进行基因敲入验证，所使用的引物的碱基序列如SEQ ID NO.5至SEQ IDNO.8所示；

对F1代小鼠进行基因分型，所使用的引物的碱基序列如SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.12所示。

9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤S5中，还包括：

对F2代小鼠进行基因分型，所使用的引物的碱基序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。