[发明专利]高纯度胰腺祖细胞的产生方法

说明书

本发明提供了一种高纯度胰腺祖细胞的产生方法，该方法关键在于通过高密度接种hPSCs准备分化板，使细胞的生长始终处于一种高度挤压的状态；同时采用Matrigel作为细胞外基质，并限定稀释倍数，使得胶的硬度在合适范围内；另外，采用梯度降低ActA浓度的方式高效产生定型内胚层。以上三个关键步骤的组合对于本方案成功实施缺一不可，在同时满足以上关键步骤的前提下产生的胰腺祖细胞，PDX1⁺NKX6.1⁺双阳性细胞效率稳定在90%以上。该方法不仅诱导效率高，且不同批次间稳定性好，不同hPSC间兼容性高；而且分化耗时短、成本低、操作简单。

技术领域

本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种胰腺祖细胞、其构建方法及其应用。

背景技术

糖尿病是一种以高血糖水平为特征的衰弱性疾病，预计到2045年，这种疾病的全球流行率将达到7亿成年人。1型和2型糖尿病（T1D、T2D）分别以自身免疫破坏和渐进性功能障碍为特征，最终患者体内胰岛β细胞耗竭，从而失去产生胰岛素的能力。目前，两种糖尿病的常规治疗方式均采用外源性胰岛素的注射。然而，由于无法确保在正常生理范围内严格保持葡萄糖水平，患者往往面临危及生命的低血糖症、高血糖症，以及心血管疾病、肾衰竭和神经病变等并发症，严重影响患者的生活质量。另一方面，与胰岛素疗法相比，尽管胰岛细胞移植可实现更好的血糖控制；但由于供体匮乏、价格高昂等因素，使得该技术难以广泛应用。基于近年来胚胎发育学与干细胞生物学的迅速发展，基于人多能干细胞（Humanpluripotent stem cells，hPSC）的体外定向分化技术有了长足的进步。使用hPSC作为种子细胞，在体外可源源不断地诱导分化为具备功能的细胞类型；因而一举克服了来源受限的难题，在转化医学领域应用前景巨大。目前，效率较高的胰腺祖细胞技术方法有：1）在分化第三阶段（后前肠）将细胞消化为单细胞，再以聚集体的形式继续分化（Cell aggregationoptimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells, Stem Cell Research,2015,14(2):185-197；Controlledinduction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cellsin vitro, EMBO Journal,2015,34(13):1759-1772），这种方法虽然大幅提高了PDX1⁺NKX6.1⁺胰腺祖细胞的分化效率（80%），但操作步骤繁琐，涉及到3D悬浮培养，成本高；2）分化第一阶段（定型内胚层诱导）结束后，将其消化为单细胞并重新接种，最后可获得纯度约80%的胰腺祖细胞（Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells intopancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1, Stem Cell Research andTherapy,2018,9:15; Highly Efficient Differentiation of Human Pluripotent StemCells into Pancreatic Progenitors Co-expressing PDX1 and NKX6.1, Methods inMolecular Biology,2020），该方法虽全程采用2D分化，但中间要转板的步骤增加了操作难度，而增加了额外Matrigel的使用带来的成本增加。此外，这两种方法的诱导时间耗时较长，大于14天，而其他分化方案的诱导效率均在55%左右（Reversal of diabetes withinsulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells,Nature Biotechnology,2014,32:1121-1133; Generation of Functional HumanPancreatic β Cells In Vitro, Cell,2014,159(2):428-439）。另外，现有方法在不同批次间的稳定性也较差。因此，在hPSC向胰岛β细胞定向分化方面，诱导效率低与批次间稳定性差是阻碍应用的2个重要原因。