[发明专利]高纯度胰腺祖细胞的产生方法

权利要求书

1.一种胰腺祖细胞的构建方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

S0：分化前，将人多能干细胞以0.2×10⁶-1×10⁶个细胞/cm²的密度接种于Matrigel包被的细胞培养板，Matrigel稀释倍数为70-100倍，达到分化要求后启动分化；

S1：使用浓度阶梯降低的ActA逐步诱导步骤S0得到的人多能干细胞分化形成定型内胚层；

S2：诱导定型内胚层分化为原始肠管；

S3：诱导原始肠管分化为后前肠；

S4：诱导后前肠分化为胰腺祖细胞；

步骤S1中分化天数至少2天，第1天ActA的浓度为150-110ng/ml，后续每一天的ActA浓度分别根据前一天使用浓度降低5-20ng/ml。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中分化天数为3天，第1天至第3天依次使用120ng/ml rhActA、110ng/ml rhActA和100ng/ml rhActA进行诱导培养。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤S1中诱导培养基包括培养基A、培养基B和培养基C，培养基A、培养基B和培养基C均包括基础培养基和添加组分，培养基A中的添加组分为120ng/ml的rhActA、3μM的CHIR99021，培养基B中的添加组分为110ng/ml的rhActA，培养基C中的添加组分为100ng/ml的rhActA；基础培养基为含有3-10mM Glucose、1-2g/LNaHCO₃、体积占比为0.1-0.3%的BSA-不含脂肪酸和体积占比为1%的GlutaMax的MCDB131培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S0在进行细胞接种之前，先将人多能干细胞制成单细胞悬液，且单细胞悬液中添加有ROCK抑制剂。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S2在含有rhFGF7的培养基中诱导培养2-3天，步骤S3在含有rhFGF7、RA、SANT1、Decursin和ML347的培养基中诱导培养2-3天，步骤S4在含有rhEGF、NIC、SANT1、Decursin和ML347培养基中诱导培养3-4天。

6.一种用于权利要求1-5任一项所述的方法的试剂盒，其特征在于：包括：

步骤S1使用的阶梯浓度的ActA；

步骤S2使用的rhFGF7；

步骤S3使用的rhFGF7、RA、SANT1、Decursin和ML347；

步骤S4使用的rhEGF、NIC、SANT1、Decursin和ML347。