[发明专利]一种耐乙醇酰胺酶、基因、表达载体、工程菌及制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种耐乙醇酰胺酶、基因、表达载体、工程菌及制备方法和应用，所述酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该酰胺酶能够耐受高浓度乙醇、可降解氨基甲酸乙酯，但不降解尿素。本发明所获得的酰胺酶可在含有高浓度乙醇条件下高效降解氨基甲酸乙酯且不降解尿素，有助于该酶高效的运用于酒精饮料中氨基甲酸乙酯的降解。本发明为实现酒精饮料中致癌物氨基甲酸乙酯的降解奠定了基础，具有巨大的经济及社会效益。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种耐乙醇酰胺酶、基因、表达载体、工程菌及制备方法和应用。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate或Urethane,简称EC)，是一种具有遗传毒性及较强致癌性的物质，广泛存在于多种传统发酵食品和酒精饮料中。鉴于EC的致癌性，尤其是乙醇可以增强EC的致癌性，世界各国和国际卫生组织对酒中的EC含量制订了严格的限量标准。人体摄取氨基甲酸乙酯主要是通过饮用酒精饮料和食物。氨基甲酸乙酯已成为影响人类健康的一个不可忽视的因素。采取有效方法消除发酵食品或酒精饮料中的氨基甲酸乙酯迫在眉睫。

目前为止，EC的消减主要有两种策略，一是间接法，即消减形成EC的前体物质(主要针对尿素)，从而减少EC的形成。此策略主要包含工艺优化法、代谢工程策略改造酒用酵母减少尿素代谢、添加酸性酶法直接降解尿素。由于尿素并非形成EC唯一前体物质，间接法不能消减其它前体物所形成的EC，并且对已经形成的EC也无法消减。第二种策略是直接法，即利用EC水解酶(Urethanase,简称UH)直接降解EC。EC水解酶可直接高效的将EC降解为无毒性的乙醇、氨和二氧化碳，是最有希望彻底解决发酵食品及酒精饮料中因EC而存在的食品安全问题的方法。目前尚无可有效应用于酒精饮料中EC直接降解的酶，主要是目前所发现的EC水解酶生化特性存在重大缺陷。其一，EC与尿素分子结构相似，目前所发现的能够降解EC的酰胺酶也可降解尿素。酒精饮料中尿素(约50mg/L)含量是EC含量(100-750μg/L)的60-500倍，它们之间存在巨大的底物竞争。其二，大部分酰胺酶类EC水解酶乙醇耐受性差，在高浓度乙醇(10％，v/v)中即失去活力，不能应用于酒精饮料中EC的降解。因此解除尿素与EC之间的底物竞争、筛选出对乙醇具有高耐受性的EC降解酶是解决酒精饮料中EC消减瓶颈问题的关键。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种耐乙醇酰胺酶、基因、表达载体、工程菌及制备方法和应用，以解决酰胺酶乙醇耐受性差及EC降解时存在的尿素与EC之间的底物竞争性问题。

基于上述目的，本发明提供了一种耐乙醇酰胺酶，所述酰胺酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。该酰胺酶能够耐受高浓度乙醇且不降解尿素。

所述氨基酸序列是经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸得到的，且编码具有耐乙醇、可降解氨基甲酸乙酯的蛋白质。比如在C端或N端添加或缺失一个或数个氨基酸残基、添加融合标签等，虽然在形式上进行修饰但不改变蛋白的酶活。

本发明还提供一种编码所述耐乙醇酰胺酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

可选的，表达基因的宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸乳球菌或酵母菌中的任意一种。优选的，表达基因的宿主菌为大肠杆菌BL21DE3。

所述酰胺酶，是通过全基因合成SEQ ID NO:1所示的基因序列，然后将酰胺酶基因在宿主菌中进行表达而得到的。

本发明还提供含所述耐乙醇酰胺酶基因的表达载体。

本发明还提供含所述耐乙醇酰胺酶基因的工程菌。

本发明还提供所述耐乙醇酰胺酶的工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)全基因合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的酰胺酶基因Leuh；