[发明专利]CRISPR、CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒及其方法

说明书

本申请实施例涉及生物检测技术领域，具体为CRISPR、CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒，包括用于靶向捕获地中海贫血相关基因的sgRNA，用于环化扩增的Y型接头，用于环化扩增的引物；所述sgRNA靶向捕获范围为：chr11:5166361‑5296578(hg38)，chr16:48994‑210817(hg38)。该CRISPR、CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒及其方法，通过CRISPR、CAS9系统靶向捕获地中海贫血变异的大片段区域，覆盖α、β、δ、δβ和εγδβ共5种类型地中海贫血突变区域，利用三代或者四代长读长测序技术，能够有效的检测出人群中可能引起地中海贫血的致病突变以及复杂结构变异以及大片段缺失，覆盖β珠蛋白基因以及相关调控基因包括HS‑40以及βLCR基因的非缺失以及缺失突变。

技术领域

本申请涉及生物检测技术领域，更具体地，涉及CRISPR、CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒及其方法。

背景技术

地中海贫血是一组常染色体隐性遗传血液病。组成珠蛋白的肽链有4种，即α、β、γ、δ链，分别由其相应的基因编码，这些基因的缺失或点突变可造成各种肽链的合成障碍，致使血红蛋白的组分改变。根据据珠蛋白肽链合成障碍的种类不同，一般将地中海贫血病分为α地中海贫血、β地中海贫血、δ地中海贫血、δβ地中海贫血和εγδβ地中海贫血。其中以β和α地中海贫血较为常见。人源α珠蛋白基因簇位于16号染色体，共包含7个基因位点：5’-zeta-pseudozeta-mu-psedudoa-l-pha-1-alpha-2-alpha-1-theta-3’。导致α地中海贫血的最常见致病变异基因是HBA1和HBA2。HBA1和HBA2基因的突变包括缺失型突变和非缺失型突变。我国最常见的缺失型HBA1和HBA2基因的突变为-α-3.7，-α-4.2，和-SEA，非缺失型突变为HBA2:c.369CG，HBA2:c.377TC，HBA2:c.427TC。除了HBA1和HBA2，HS-40调节区域的缺失或者突变也会导致α地中海贫血，例如NC_000016.10:g.56407_153678del达97kb的缺失。人源β珠蛋白(betaglobin)基因簇位于11号染色体，共包含5个基因位点：5’-epsilon-gamma-G-gamma-A-delta-beta-3’。导致β地贫的遗传变异主要为HBB基因的点突变或小片段缺失，少数为大片段缺失。但目前主要检测的主要是已知常见的17个位点19种突变，包括c.-82CA、c.-80TC、c.-79AG、c.-78AG、c.78AC、c.11_8delAAAC、c.79GA、c.92+1GT、c.92+5GC、c.316197CT、c.2TGc.45_46insG、c.84_85insG、c.52AT、c.94delC、c.126_129delCTTT、c.130GT、c.216_217insA、c.216_217insT等。δ地中海贫血是由珠蛋白δ链合成异常引起的。δ突变的存在可能会掩盖β地中海贫血特征的诊断，因为在β地中海贫血中，HbA2升高，但δ的存在可能会降低HbA2浓度，从而掩盖了对β地中海贫血特征的诊断。δβ地中海贫血主要是累及δ珠蛋白以及β珠蛋白基因的缺失，部分缺失类型包括Aγ、Gγ以及ε珠蛋白基因的缺失。我国最常见的δβ地贫为中国Gγ+(Aγδβ)0地贫，此类缺失突变与β地贫点突变的双重杂合子可导致中间型或重型地中海贫血。