[发明专利]CRISPR、CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒及其方法

权利要求书

1.CRISPR、CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒，其特征在于：包括用于靶向捕获地中海贫血相关基因的sgRNA，用于环化扩增的Y型接头，用于环化扩增的引物；

所述sgRNA靶向捕获范围为：chr11:5166361-5296578(hg38)，chr16:48994-210817(hg38)，所述sgRNA捕获区域为，所述sgRNA序列为：UAAUACGACUCACUAUAGGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU。

2.根据权利要求1所述的CRISPR、CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒，其特征在于：所述Y型接头序列为：Y型通用接头序列：ACAATTTGCACGAT-ATGCTTAGACACCTCCGATTACG[index]TTCG-TACGAATCTGTGG。

3.根据权利要求1所述的CRISPR、CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒，其特征在于：所述引物序列为：F:ACAATTTGCACGATATGCTTAGACACCTR:CCACAGATTCGTA[index]CGTAATCGG。

4.根据权利要求1所述的CRISPR、CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒，其特征在于：所述sgRNA靶向切割位点可以靶向捕获但限于OR52Z1、OR51V1、HBB、HBD、HBBP1、BGLT3(HS-40)、HBG1、HBG2、HBE1、OR51AB1P、POLR3K、SNRNP25、RHBDF1、MPG、NPRL3、HBZ、LOC107983982、HBZP1、HBM、HBAP1、HBA2、HBA1、HBQ1、LUC7L地中海贫血突变相关区域，包含chr11:5167971-5295261(hg38)以及chr16:48994-210817(hg38)区域内的任意类型突变。

5.根据权利要求1-4任意所述的CRISPR、CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒，其特征在于，包括以下筛查方法：制备受试者样本；CRISPR、CAS9靶向捕获系统捕获chr11:5166361-5296578(hg38)，chr16:48994-210817(hg38)片段；构建长片段测序文库；测序并分析地中海贫血基因突变类型。

6.根据权利要求3所述的CRISPR、CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒的筛查方法，其特征在于，所述筛查步骤具体为：

sgDNA的序列设计：选择地中海贫血相关区域，利用CHOPCHOP工具设计sgRNA；

利用NEB快速去磷酸化试剂盒对DNA去磷酸化，37℃孵育10分钟后，80℃孵育2分钟，终止反应；

CRISPR、CAS9-sgRNA复合物的组装，彻底混合并在微量离心机中离心，在37℃下孵育15分钟，向每个样品中加入1μl蛋白酶K在室温下孵育10分钟；

加入10ul的DNA，1μL 10mM dATP和2uL of Taq DNA聚合酶，37℃孵育15分钟，Cas9酶切，之后72℃孵育5分钟，再在DNA末端加上一个A；

接头连接，接头连接体系如下表，22℃孵育10分钟；

加入1ul核酸外切酶Ⅲ，37℃孵育30分钟，之后70℃孵育30分钟灭活；

加入30ulDNA富集磁珠，室温孵育10分钟，后置于磁力架之上静置5分钟，弃掉上清，用加入100ul 80％乙醇，30s之后吸出，重复一次，之后开盖，空气中风干2分钟，加入24.5ul无核酸酶水，孵育2分钟之后静置于磁力架上，待液体澄清后，洗出上清至新的PCR管中；

接头环化；60℃孵育1小时，之后80℃孵育10分钟灭活环化酶，后加入4.7ul10X NEB限制性内切酶缓冲液以及核酸外切酶I与III各1ul，后37℃孵育30分钟；

滚环扩增，将反应体系30℃孵育6小时，之后60℃孵育10分钟，后电泳查看扩增情况；

扩增产物用nanopore进行测序。

7.根据权利要求4述的CRISPR、CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒的筛查方法，其特征在于，所述扩增产物用nanopore进行测序具体为：将每个DNA样品稀释为1ng/ul，之后室温孵育10分钟，65摄氏度孵育5分钟，冰上孵育1分钟；

将以上反应产物直接加入下方体系中，之后室温孵育10分钟，65摄氏度孵育5分钟，冰上孵育1分钟；

配制AMII接头蛋白连接体系，室温孵育15min，之后按照照1:1的比例向样品管中加入AMPure XP磁珠，将试管转移到磁力架上，静置2min，弃上清，加入200μlSFB重悬并离心，之后加入加入15μlEB溶液室温孵育2min，之后放置于磁力架上，静置2min，待磁珠被吸引至靠近磁力架的一侧或溶液变澄清，小心吸取上清，最终得到文库，使用MinION、GridION Mk1、PromethION P24测序仪上机测序。