[发明专利]一种鉴定雌性克氏原螯虾的SSR标记及其应用

说明书

本发明属于动物分子标记筛选领域。具体涉及一种鉴定雌性克氏原螯虾的SSR标记及其应用。本发明主要步骤为(1)分别提取雌、雄性克氏原螯虾基因组DNA。(2)对雌雄群体克氏原螯虾的DNA样本进行PCR检测，设计相关引物扩增目片段，通过琼脂糖电泳检测目的片段是否被扩增出。(3)利用PAGE胶电泳检测并进行统计分析。通过PAGE胶电泳后显影、读带，对雌雄克氏原螯虾群体间的带型进行统计分析。结果表明：检测到的雌性和雄性克氏原螯虾群体样本显示所有雌性或雄性样本在PCM1237位点含有A、B、C三种等位基因，雌性克氏原螯虾基因型为纯合型或杂合型，而雄性克氏原螯虾基因型仅为纯合型。即杂合型一定是雌性克氏原螯虾。

技术领域

本发明属于水产动物分子标记筛选技术领域，具体涉及一种鉴定雌性克氏原螯虾的SSR分子标记的筛选及其应用。

背景技术

克氏原螯虾(Procambarua clarkii)俗称小龙虾，隶属于十足目(Decapoda)、螯虾科(Ambaridae)，是存活于淡水中的一种甲壳类动物。克氏原虾原产于美国南部和墨西哥东北部，经由日本引入中国南京地区，后逐步向整个长江流域等地区扩散；由于其味道鲜美，营养丰富，深受人们喜爱，目前小龙虾已成为我国重要的经济水产品。

目前，虽然关于克氏原螯虾性别鉴定的分子标记已有相关的专利文献和报道。例如沈宇东等，2021提供了一种克氏原螯虾遗传性别鉴定的分子标记及其筛选方法和应用(申请号2021112932524)，但是该文献中标记引物只能特异扩增出雄性克氏原螯虾带型，而雌性克氏原螯虾则不能扩增出特异性条带(即，无特异序列特征)。沈宇东等2021年专利申请所用的性别分子标记若未扩增出特异性条带，不能充分说明受检测的虾即为雌性，这种方法极易导致假阳性的结论。为此，本发明开发在雌性克氏原螯虾中能特异扩增出具有明确序列特征的标记，对克氏原螯虾雌性个体的鉴定具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种高效的鉴别雌性克氏原螯虾的分子标记及其应用。本发明筛选出的SSR分子标记PCM1237，不仅在雄、雌性克氏原螯虾中均能扩增出特异性条带，而且通过选择其特异带型能鉴定出的个体一定是雌性克氏原螯虾。因此，本发明的分子标记PCM1237可确切地鉴定出雌性克氏原螯虾。

本发明操作简便，实验步骤少、成本低，能广泛应用在生产实践中。经检测，该筛选及鉴定方法能有效鉴别雌性克氏原螯虾，是一种基于DNA序列能有效鉴别雌性克氏原螯虾的分子标记及筛选方法和鉴定方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种SSR标记在雌性克氏原螯虾鉴定中的应用，所述的应用包括下列步骤：

1)分别提取雌、雄性克氏原螯虾基因组DNA，每个性别样本至少提取150尾；

2)设计引物：根据克氏原螯虾基因组测序数据，利用Primer3软件设计正向引物PCM1237-F5'-CGCACACTTCTTCACCCTCT-3'和反向引物PCM1237-R 5'-AGGAGTCTTTTAACATGAGAGATTTT-3'；

3)对雌、雄群体克氏原螯虾的DNA样本进行PCR检测：

以正向引物PCM1237-F 5'-CGCACACTTCTTCACCCTCT-3'，

和反向引物PCM1237-R 5'-AGGAGTCTTTTAACATGAGAGATTTT-3'扩增目的片段，利用琼脂糖电泳检测目的片段是否被扩增出；

4)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并进行统计分析：将扩增出的PCR产物用4％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，电泳胶板用0.2％的硝酸银溶液进行染色，用含有0.5％甲醛溶液的0.5M氢氧化钠溶液进行显影、漂洗和晾干，对上述各个群体进行带型统计分析；