[发明专利]干细胞来源的视网膜色素上皮的基于MACS的纯化

说明书

提供了富集源自干细胞的视网膜色素上皮(RPE)细胞群体的方法。这样的方法可以包括通过从RPE细胞的起始群体中耗竭CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞和/或CD90阳性的细胞来除去污染细胞。

本申请是分案申请，其对应的母案申请的申请号为201680060869.2，申请日期为2019年9月7日，发明名称为“干细胞来源的视网膜色素上皮的基于MACS的纯化”。

本申请要求2015年9月8日提交的美国临时申请号62/215,272的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明一般而言涉及干细胞生物学领域。更具体地，涉及富集干细胞来源的视网膜色素上皮细胞群体的方法。

背景技术

视网膜是组织的光敏层，其布置在眼睛的内表面。视网膜中的感光器细胞(杆或锥细胞)对光直接敏感，并将化学光信号转化为触发神经冲动的电活动。视网膜色素上皮细胞(RPE)是一层形成血-视网膜屏障的色素细胞。RPE细胞在维持视觉功能以及从视网膜下腔至血液的离子、水和代谢终产物的转运中发挥重要作用(Strauss等人，2005)。此外，RPE细胞通过分泌免疫抑制因子来建立眼的免疫赦免(immune privilege)。RPE细胞的紊乱或损伤可导致视网膜变性、失去视觉功能和失明。视网膜的几种疾病(包括急性和年龄相关性黄斑变性和贝斯特病)涉及RPE的退化；因此，细胞替代治疗是保持视力的一种可能的治疗选择(Buchholz等人，2009)。

通常，干细胞是未分化的细胞，其可以产生一系列成熟的功能细胞。例如，造血干细胞可产生任何不同类型的终末分化血细胞。胚胎干(ES)细胞来自胚胎并且是多能的，因此具有发育成任何器官或组织类型(包括RPE细胞)的能力。

在2006年诱导多能干细胞(iPS细胞)从成年小鼠体细胞的产生提供了干细胞研究、药物研发、疾病模型和细胞治疗的重大突破(Takahashi等人，2006)。人iPSC可以分化为特定的细胞类型，并且具有用于再生医学的患者特异性、免疫匹配的细胞的潜力(Yu等人，2007)。

已显示iPSC产生眼细胞，包括RPE细胞(Hirami等人，2009)。然而，将iPSC来源的RPE细胞用于治疗、筛选测定、视网膜疾病模型和RPE生物学研究需要从分化的RPE细胞群体中除去污染细胞和/或富集目的群体。

发明内容

本发明的实施方案通过提供用于通过除去CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞和/或CD90阳性的细胞获得来自起始RPE细胞群体的视网膜色素上皮(RPE)细胞富集群体的方法克服了本领域的主要缺陷。在某些实施方案中，起始RPE细胞群体可以获自多能干细胞，例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

在一个实施方案中，提供了用于提供富集的视网膜色素上皮(RPE)细胞群体的方法，其包括(a)获得包含RPE细胞的起始细胞群体和(b)通过从其中除去CD24阳性的细胞、CD56阳性的细胞和/或CD90阳性的细胞，来富集所述细胞群体的RPE细胞，由此提供与起始细胞群体相比富含RPE细胞的RPE富集细胞群体。在一些方面，起始细胞群体是未经遗传改造或遗传修饰的。在一些方面，富集细胞群体不包括遗传改造细胞。因此，在某些方面，RPE富集细胞群体未经遗传改造或遗传修饰。

在一些方面，所述方法可以进一步包括测定RPE富集群体中RPE细胞的富集水平。在某些方面，通过使用视网膜上皮特异性标记来测定富集水平。例如，视网膜上皮特异性标记可以是BEST1、CRALBP、TYRP1、PMEL17或MITF。在具体的方面，如通过BEST1分选测定的，与起始细胞群体相比，RPE富集细胞群体富含RPE细胞。

在某些方面，RPE富集群体是至少95％，96％，97％，98％或99％的RPE细胞。在其他方面，RPE富集群体是基本上纯的RPE细胞。

在实施方案的某些方面，起始细胞群体由多能干细胞制备。在其他方面，多能干细胞是诱导多能干细胞。例如，RPE细胞可以是人RPE细胞。