[发明专利]一种基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法

说明书

一种基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，包括使用组织块进行细胞培养；依次使用PBS缓冲液、基础培养基和完全培养基对培养筒进行环境改善；将细胞浓缩液接种入培养筒的纤维外空间中；检测葡萄糖消耗量并依次增大完全培养基体积和完全培养基流速；最后收集纤维外空间中的溶液，对溶液进行分离、提纯获得外泌体。本发明中中空纤维生物反应器的中空纤维柱表面积更大，可容纳更多细胞生长，获得更多外泌体；通过依次使用PBS缓冲液、基础培养基和完全培养基对培养筒进行预处理可确保系统不会渗漏，并将系统建立为适于细胞生长的环境；通过细胞扩大培养可使得细胞数量大量增加，从而获取更多的外泌体。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法。

背景技术

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小囊泡，其直径在30-150nm。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。近几年，外泌体作为细胞间的信息传递工具及各种疾病的生物标志物而引起广泛的关注，外泌体具有在生物医药及疾病诊断领域的应用具有很大的潜力。

现有的外泌体提取方法主要通过对细胞进行平板培养，然后收获细胞并进行分离提纯来提取获得外泌体，上述方法中细胞培养量较低，因此提取获得的外泌体量较少，不利于进行外泌体工业化的大规模生产。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够实现外泌体持续大量产出，便于进行外泌体工业化大规模生产的外泌体制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：一种基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，包括以下步骤：

1）细胞培养：获取组织块并将组织块置于平盘中进行细胞贴壁培养；

2）系统环境改善：依次使用PBS缓冲液、基础培养基和完全培养基对培养筒进行预处理；

3）接种细胞：分离平盘中培养完成的细胞，使用培养液对细胞进行重悬、浓缩，将中空纤维生物反应器内的完全培养基换成新鲜的完全培养基，然后将细胞浓缩液接种入培养筒的纤维外空间中；

4）细胞扩大培养：将培养筒与双头泵连接，打开双头泵使得储液瓶中新鲜的完全培养基流入培养筒的纤维内管路中，并实时监测完全培养基中葡萄糖浓度，每当葡萄糖浓度消耗50%时，依次增大完全培养基体积和完全培养基流速；

5）外泌体获取：收集纤维外空间中的溶液，对溶液进行分离、提纯获得外泌体。

上述基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，优选的，所述步骤2）中对培养筒预处理包括以下步骤：

①、向储液瓶中加入PBS缓冲液，连接储液瓶与培养筒，打开培养筒的第一内阀门和第二内阀门，手动按压单向阀将PBS缓冲液打入纤维内管路中，观察到气泡冒出后关闭第一内阀门和第二内阀门；

②、打开培养筒的第一外阀门和第二外阀门，向纤维外空间中加入PBS缓冲液使其充满培养筒；

③、关闭第一外阀门和第二外阀门，打开第一内阀门和第二内阀门，将培养筒与双头泵连接使得PBS缓冲液在纤维内管路循环，并将中空纤维生物反应器放入培养箱内，PBS缓冲液循环流速设定在80-90ml/min，循环时间设定在24-48h；

④、将PBS缓冲液换成基础培养基，重复步骤①-③；

⑤、将基础培养基换成完全培养基，重复步骤①-③。

上述基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，优选的，所述步骤3）中的培养液为步骤1）中平盘内培养过细胞的培养基。

上述基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，优选的，所述步骤3）中细胞浓缩液内细胞存活率大于90%，接种细胞后，细胞能够覆盖中空纤维柱表面积50%以上。