[发明专利]一种基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法

权利要求书

1.一种基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）细胞培养：获取组织块并将组织块置于平盘中进行细胞贴壁培养；

2）系统环境改善：依次使用PBS缓冲液、基础培养基和完全培养基对培养筒进行预处理；

3）接种细胞：分离平盘中培养完成的细胞，使用培养液对细胞进行重悬、浓缩，将中空纤维生物反应器内的完全培养基换成新鲜的完全培养基，然后将细胞浓缩液接种入培养筒的纤维外空间中；

4）细胞扩大培养：将培养筒与双头泵连接，打开双头泵使得储液瓶中新鲜的完全培养基流入培养筒的纤维内管路中，并实时监测完全培养基中葡萄糖浓度，每当葡萄糖浓度消耗50%时，依次增大完全培养基体积和完全培养基流速；

5）外泌体获取：收集纤维外空间中的溶液，对溶液进行分离、提纯获得外泌体。

2.根据权利要求1所述的基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，其特征在于，所述步骤2）中对培养筒预处理包括以下步骤：

①、向储液瓶中加入PBS缓冲液，连接储液瓶与培养筒，打开培养筒的第一内阀门和第二内阀门，手动按压单向阀将PBS缓冲液打入纤维内管路中，观察到气泡冒出后关闭第一内阀门和第二内阀门；

②、打开培养筒的第一外阀门和第二外阀门，向纤维外空间中加入PBS缓冲液使其充满培养筒；

③、关闭第一外阀门和第二外阀门，打开第一内阀门和第二内阀门，将培养筒与双头泵连接使得PBS缓冲液在纤维内管路循环，并将中空纤维生物反应器放入培养箱内，PBS缓冲液循环流速设定在80-90ml/min，循环时间设定在24-48h；

④、将PBS缓冲液换成基础培养基，重复步骤①-③；

⑤、将基础培养基换成完全培养基，重复步骤①-③。

3.根据权利要求1所述的基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，其特征在于，所述步骤3）中的培养液为步骤1）中平盘内培养过细胞的培养基。

4.根据权利要求1所述的基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，其特征在于，所述步骤3）中细胞浓缩液内细胞存活率大于90%，接种细胞后，细胞能够覆盖中空纤维柱表面积50%以上。

5.根据权利要求1所述的基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，其特征在于，所述步骤3）中将细胞浓缩液接种入培养筒的纤维外空间中包括：关闭第一内阀门和第二内阀门，打开第一外阀门和第二外阀门，使用两支针筒分别与第一外阀门和第二外阀门连通，针筒内含有细胞浓缩液；使用针筒对细胞浓缩液来回冲打，直至两支针筒内液体浑浊度一致。

6.根据权利要求1所述的基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，其特征在于，所述步骤4）中在将培养筒与双头泵连接前，将培养筒往下旋转180°，静置20-40min，再将培养筒转正，静置20-40min。

7.根据权利要求1所述的基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，其特征在于，所述步骤4）中细胞初代培养时，完全培养基体积为125ml，完全培养基流速为100ml/min。

8.根据权利要求7所述的基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，其特征在于，所述步骤4）中每当葡萄糖浓度消耗50%时，依次增大完全培养基体积和完全培养基流速分别设定为：完全培养基体积为250ml，完全培养基流速为100ml/min；完全培养基体积为500ml，完全培养基流速为120ml/min；完全培养基体积为1000ml，完全培养基流速为140ml/min。

9.根据权利要求1所述的基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，其特征在于，所述步骤5）中当葡萄糖消耗量大于1g/天时，收集纤维外空间溶液包括：关闭第一内阀门，打开第二内阀门，使用针筒从第一外阀门和/或第二外阀门吸取纤维外空间液体，使得储液瓶中液体通过第二内阀门回到纤维外空间。

10.根据权利要求1所述的基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，其特征在于，所述步骤5）中对溶液进行分离、提纯包括：

将溶液至于离心管中，在2000-3000g、4℃下离心12-20min，收集上清液；

将上清液在8000-10000g、4℃下离心15-20min，离心完成后继续收集上清液；

将上清液经过0.22μm滤膜过滤，收集过滤液；

将过滤液在8000-10000g、4℃下离心60-70min，收获外泌体。