[发明专利]一种通过测序方法检测基因编辑脱靶的方法

说明书

一种通过测序方法检测基因编辑脱靶的方法，包括DNA提取、sgRNA准备、DNA超声并纯化、DNA末端处理、核酸外切酶处理、T4PNK处理、DNA环化、线性DNA消化、Cas9消化、DNA处理、文库扩增十一个步骤。本发明的原理是利用Cas9体外核酸酶特性，在体外对基因组DNA进行切割，产物经处理后，通过测序或其他手段，实现对脱靶位点的筛选。Cas9体外消化基因组DNA、测序，实现了无偏检测。相比于现有GUIDE‑seq技术，不需额外引入dsODN，在各步骤共同支持下，在步骤10中实现了利用Cas9自身特性就可以切割目的片段，避免了转染效率不可控的问题；而且能够对全基因组进行检测，解决了dsODNs标签可能检测不到的遗漏情况。基于上述，本发明具有好的应用前景。

技术领域

本发明涉及检测方法技术领域，特别是一种通过测序方法检测基因编辑脱靶的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9系统因为组成简单、特异性好、切割效率高，经改造后成为新一代基因编辑工具，所以并迅速被广泛应用，其快速、准确的基因编辑能力，使通过基因定点突变治疗人类遗传疾病成为可能。

现有的CRISPR/Cas9脱靶效应检测方法，如GUIDE-seq技术检测时，是将CRISPR系统质粒和特定序列的短双链寡核苷酸(dsODN，含硫代磷酸二酯键修饰，用以稳定双链DNA)转染进入细胞系，然后在Cas9剪切产生双链断裂、并采用非同源修复时就有可能将转染进细胞的双链DNA整合到基因组中，之后提取基因组按照正常的二代测序建库流程建好文库后，再经过一步靶向扩增后再用二代测序检测相关脱靶位置，进而完成检测流程。目前的CRISPR/Cas9脱靶效应检测方法由于技术所限还存在局限性；首先，dsODN需要转染入细胞系，使其只能适用于易转化的细胞，并且转染效率也是不可控因素之一(存在脱靶效应)；第二“dsODNs标签”是否都能够整合到细胞所有的DSBs(DNA双链断裂)并不清楚，而且其只能检测断裂时期的DSBs，对于已经修复的则不能检测(灵敏度不高、检测不全面)。基于上述，现有的CRISPR/Cas9脱靶效应检测方法还存在很大的改进余地。

发明内容

为了克服现有的CRISPR/Cas9脱靶效应检测方法由于技术限制，在基因编辑过程中存在的脱靶效应，检测灵敏度不高、检测范围不全面的弊端，本发明提供了利用Cas9核酸酶对基因组DNA进行体外切割，在相关材料及步骤共同作用下，检测灵敏度高，避免了转染效率不可控，且能够对全基因组进行检测的一种通过测序方法检测基因编辑脱靶的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种通过测序方法检测基因编辑脱靶的方法，其特征在于包括DNA提取、sgRNA准备、DNA超声并纯化、DNA末端处理、核酸外切酶处理、T4 PNK处理、DNA环化、线性DNA消化、Cas9消化、DNA处理、文库扩增十一个步骤；所述DNA提取包括取样品、离心沉淀、恒温孵育、吹打孵育、吹打涡旋、再次吹打孵育、孵育去清、Qubit荧光定量仪测浓度八个分步骤；所述sgRNA准备包括选取EMX1基因的靶点序列及质粒公司设计质粒、酶解体外转录、纯化线性化质粒并洗脱、体外转录、产物纯化五个分步骤；所述DNA超声并纯化包括超声仪超声DNA、纯化、检测DNA浓度及DNA片段大小三个分步骤；所述DNA末端处理包括DNA末端补平、Adapter连接、对反应产物进行纯化并水洗脱DNA三个分步骤；所述核酸外切酶处理、T4 PNK处理、DNA环化、线性DNA消化、Cas9消化、文库扩增均包括准备材料并实验、对反应产物进行纯化并水洗脱DNA两个分步骤；所述DNA处理包括DNA末端补平、Adapter连接、对反应产物进行纯化分选并洗脱DNA；所述文库扩增包括准备材料并实验、对反应产物进行纯化两个分步骤。