[发明专利]一种通过测序方法检测基因编辑脱靶的方法

权利要求书

1.一种通过测序方法检测基因编辑脱靶的方法，其特征在于包括DNA提取、sgRNA准备、DNA超声并纯化、DNA末端处理、核酸外切酶处理、T4 PNK处理、DNA环化、线性DNA消化、Cas9消化、DNA处理、文库扩增十一个步骤；所述DNA提取包括取样品、离心沉淀、恒温孵育、吹打孵育、吹打涡旋、再次吹打孵育、孵育去清、Qubit荧光定量仪测浓度八个分步骤；所述sgRNA准备包括选取EMX1基因的靶点序列及质粒公司设计质粒、酶解体外转录、纯化线性化质粒并洗脱、体外转录、产物纯化五个分步骤；所述DNA超声并纯化包括超声仪超声DNA、纯化、检测DNA浓度及DNA片段大小三个分步骤；所述DNA末端处理包括DNA末端补平、Adapter连接、对反应产物进行纯化并水洗脱DNA三个分步骤；所述核酸外切酶处理、T4 PNK处理、DNA环化、线性DNA消化、Cas9消化、文库扩增均包括准备材料并实验、对反应产物进行纯化并水洗脱DNA两个分步骤；所述DNA处理包括DNA末端补平、Adapter连接、对反应产物进行纯化分选并洗脱DNA；所述文库扩增包括准备材料并实验、对反应产物进行纯化两个分步骤。

2.根据权利要求1所述的一种通过测序方法检测基因编辑脱靶的方法，其特征在于，DNA提取，样品是人细胞样品；离心沉淀中，取细胞离心去清，然后细胞沉淀重悬于Tris-HCl+EDTA+ddH2O液后转移至离心管；恒温孵育中，加入Protein K孵育；吹打孵育中，加入RNaseA吹打混匀孵育；吹打涡旋中，加Buffer AL缓冲液吹打混匀，然后加Buffer MB涡旋；再次吹打孵育中，加入MagAttract Suspension G吹打混匀孵育，然后缓慢完全去清；孵育去清需要进行五次，头三次加入Buffer MW1混匀，然后金属浴孵育，缓慢完全去清；后两次加nuclease-free water，然后缓慢完全去清。

3.根据权利要求1所述的一种通过测序方法检测基因编辑脱靶的方法，其特征在于，sgRNA准备，选取EMX1基因的靶点序列是GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA；酶解体外转录中，是将序列验证的sgRNA质粒3-5μg与HindIII-HF酶解，进行体外转录，并在PCR仪中采用CutSmartbuffer、sgRNA plasmid、HindIII-HF、Nuclease-free H 2O进行实验；纯化线性化质粒并洗脱中，是用纯化试剂纯化线性化质粒，nuclease-free water进行洗脱；体外转录中，采用10×reaction buffer、HindIII digested DNA、ATP solution、GTP solution、UTPsolution、CTP solution、T7 RNA Polymerase Mix孵育，再加DNase I消化；产物纯化，需要进行七个操作流程。

4.根据权利要求1所述的一一种通过测序方法检测基因编辑脱靶的方法，其特征在于，DNA超声并纯化，超声仪超声DNA中，DNA需要剪切成300bp长度左右；纯化中，采用DNA纯化磁珠；检测DNA浓度及DNA片段大小中，采用Qubit荧光定量仪测浓度，跑胶检测DNA片段大小；DNA末端处理，DNA末端补平中，投入DNA、End Prep Mix 4、ddH2O使用移液器轻轻吹打混匀，并离心将反应液收集至管底，在PCR仪中进行实验；Adapter连接中，投入上一步产物、RapidLigation buffer 2、Rapid DNA ligase、DNA Adapter X使用移液器轻轻吹打混匀，并短离心将反应液收集至管底，在PCR仪中进行实验；对反应产物进行纯化并水洗脱DNA中，采用单轮分选，用水洗脱DNA方式。

5.根据权利要求1所述的一种通过测序方法检测基因编辑脱靶的方法，其特征在于，核酸外切酶处理，准备材料并实验中，投入Exonuclease I Reaction Buffer、LambdaExonuclease、Exonuclease I、Adapter ligated DNA，在PCR仪中进行实验；T4 PNK处理，准备材料并实验中，投入T4 DNA Ligase Buffer、USER Enzyme、T4 Polynucleotide Kinase、核酸外切酶处理后的DNA在PCR仪中进行实验。