[发明专利]一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花及其制剂的方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花及其制剂的方法。所述特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列为5'‑TCCAACAGTTTTTCTTTTATTTTTA‑3'，下游引物的核苷酸序列为5'‑GTCTTAGTGTATACGAGTTAAAAAA‑3；TaqMan探针的核苷酸序列为5'FAM‑TAAAAAATGAAAGCCCAAAACACAA‑BQ13'。TaqMan探针法是首次应用到山银花的鉴别；专属性强，从物种DNA层面鉴别山银花，本发明所述引物及探针序列是山银花所专有，其他物种或药材则无此序列；灵敏度高，只要ng级别的模板DNA浓度，当药材、饮片及制剂中掺入1％的山银花药材或粉末即可检出；适用性广，不受药材生长环境及外观性状的影响，性状完全破碎的药材粉末均可应用，对于山银花制剂中可检查山银花原料药材基源是否正确，即使经过加工炮制的山银花制剂也适用。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及制剂及药材检验检测方法，尤其涉及一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花及其制剂的方法。

背景技术

山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬或黄褐毛忍冬的干燥花蕾或带初开的花，根据查阅文献及市场调研发现目前市场上销售流通的山银花基原样品主要为灰毡毛忍冬和黄褐毛忍冬，其中以灰毡毛忍冬最为常见。金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花。金银花与山银花均用于温病发热、喉痹、热毒血痢、风寒感冒等病症。自2005年版《中国药典》将山银花列出作为单个药材后，由于金银花价格昂贵，市场上常有用山银花假冒或混淆金银花的现象；两者虽然在药理作用上有一定共性，但在某些药理作用上两者还是有一定差异，如山银花中存在致敏反应的皂苷成分，而金银花中皂苷则不发生过敏反应。因此为保证临床用药安全，建立快速简便灵敏度好的检测方法是十分必要的。

通过查阅文献，目前鉴别山银花与金银花的主要方法为性状及液相色谱法，性状鉴别易受采收加工及炮制方法的影响，同时性状鉴别对检验人员专业能力及水平要求较高；液相鉴别方法主要根据化学成分的差异进行鉴别，山银花(灰毡毛忍冬)中含有灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙，金银花则不含这两种化学成分，这种鉴别方法需要高效液相色谱仪，需要购买相应的对照品，成本较高。目前虽已有金银花与山银花的鉴别方法，但该方法检测灵敏度较低，成本高，对检验人员专业技术水平要求较高，不适合广泛应用。

TaqMan探针法是实时荧光PCR方法的一种，该法是在原有实时荧光PCR基础上引入探针。探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，当探针引物特异性结合，DNA模板开始扩增，当Taq DNA聚合酶碰到探针5’端荧光报告基团，外切酶将5’端报告基团切割，游离出来，发出荧光信号。该方法目前主要应用到食品领域，对于药品领域则应用较少。与传统理化鉴别方法相比TaqMan探针法特异性好，灵敏度高，不仅可以鉴别药材及饮片，还可以鉴别山银花制剂中原料药材的真伪。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花及其制剂的方法。本发明设计出山银花共同特有的特异性引物及TaqMan探针，这一特异引物和探针可以同时检查金银花药材及制剂中有无掺加山银花，山银花药材及饮片是否为正品基源山银花，山银花制剂中是否投料山银花，原料药基源是否正确。该方法灵敏度高，特异性好，重复性好，成本低，对于检查金银花药材、饮片及制剂中是否掺有山银花，及山银花制剂中是否投料山银花药材或粉末具有较好适用性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花及其制剂的方法，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为5'-TCCAACAGTTTTTCTTTTATTTTTA-3'，所述下游引物的核苷酸序列为5'-GTCTTAGTGTATACGAGTTAAAAAA-3；所述TaqMan探针5'端标记荧光素基团FAM，3'端标记淬灭基团BHQ1，所述TaqMan探针的核苷酸序列为5'FAM-TAAAAAATGAAAGCCCAAAACACAA-BQ13'。