[发明专利]一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检测引物、试剂盒及应用

说明书

本发明公开一种非洲猪瘟病毒的野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光定量PCR检测引物，针对p72基因的实时荧光PCR扩增引物如下所示：上游引物p72‑F1：TGCGATGATGATTACCTTGC，其为SEQ ID NO.1序列；下游引物p72‑R1：GATACCACAAGATCAGCCGT，其为SEQ ID NO.2序列；针对CD2v基因的实时荧光PCR扩增引物如下所示：上游引物CD2v‑F1：ATGAAGAAGAACAATGTCAGCA，其为SEQ ID NO.3序列；下游引物CD2v‑R1：ACTGATAACGACTGTAAGGCT，其为SEQ ID NO.4序列。

技术领域

本发明属于病毒分子生物学，具体涉及一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v 基因缺失毒株双重荧光PCR检测引物、试剂盒及应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African SwineFeverVirus,ASFV)感染引起的一种急性、烈性猪传染病，该病发病过程短、最急性和急性感染死亡率高达100％，是生猪产业危害最严重的烈性传染病(Galindo and Alonso 2017)。ASF是世界动物卫生组织(OIE)要求报道的动物疫病，ASFV 属于我国动物病原微生物名录一类动物病原微生物。

ASFV属于非洲猪瘟科非洲猪瘟属，为正二十面体结构的DNA病毒，分类上接近虹彩病毒科(Iridoviridae)，其DNA结构以及复制方式则与痘病毒科(Poxv iridae)相似，ASFV颗粒有囊膜，直径175～215nm，核衣壳20面体对称。基因组由单分子线状双股DNA组成，大小为170～190kbp。非洲猪瘟病毒基因组具有遗传多样性，目前至少存在24个基因型(基于B646L基因的序列分析)和8个血清群(基于CD2v蛋白的血清学分析)，我国及东南亚地区流行的毒株与东欧及俄罗斯流行的毒株均属于基因II型。有研究表明，ASFV Georgia2007株缺失 MGF360和MGF505的6个基因(MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、 MGF360、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L)可使病毒毒力显著减弱，我国分离的ASFV SY18株在缺失MGF基因的同时缺失CD2v，基因缺失株毒力显著减弱并具有较好的安全性和保护效果。因此，将ASFV基因缺失毒株应用于疫苗开发具有良好的研发和应用前景。

ASF的发病症状与其他多种猪病的症状相似，在临床上进行鉴别诊断难度较大，必须借助实验室诊断方法。非洲猪瘟病毒(ASFV)建立感染后，抗体在感染一定时期后才会生成，因此早期筛查最佳的选择还是进行抗原检测。目前检测ASFV抗原的常用方法有PCR、荧光定量PCR、直接免疫荧光技术(DIF)与红细胞吸附试验(HAD)四种，但现有的检测方法均是基于非洲猪瘟野毒感染开发建立的，在未来该类基因缺失疫苗投入使用后，现有的检测方法将无法区分野毒感染阳性和疫苗免疫阳性，为了鉴别非洲猪瘟疫苗免疫动物和自然感染动物，有必要建立野毒株和疫苗株的鉴别检测技术。

发明内容

本发明目的在于提供一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检测引物、试剂盒及应用，其中采用TaqMan探针荧光定量检测法，建立针对p72基因和CD2v基因的双重荧光定量PCR检测方法，可以有效区分野毒感染和含有CD2v基因缺失的疫苗毒株，该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，为非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗毒株的鉴别诊断提供了良好的技术支持。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR 检测引物，针对p72基因的实时荧光PCR扩增引物如下所示：

上游引物p72-F1：TGCGATGATGATTACCTTGC，其为SEQ ID NO.1序列；

下游引物p72-R1：GATACCACAAGATCAGCCGT，其为SEQ ID NO.2序列；