[发明专利]一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检测引物、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检测引物，其特征在于，针对p72基因的实时荧光PCR扩增引物如下所示：

上游引物p72-F1：TGCGATGATGATTACCTTGC，其为SEQ ID NO.1序列；

下游引物p72-R1：GATACCACAAGATCAGCCGT，其为SEQ ID NO.2序列；

针对CD2v基因的实时荧光PCR扩增引物如下所示：

上游引物CD2v-F1：ATGAAGAAGAACAATGTCAGCA，其为SEQ ID NO.3序列；

下游引物CD2v-R1：ACTGATAACGACTGTAAGGCT，其为SEQ ID NO.4序列。

2.一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检测探针，其特征在于，针对p72基因的荧光探针p72-P1，如下所示：

探针p72-P1：FAM-TCTGGCCCTGCCCACCACGT-BHQ1，其为SEQ ID NO.5序列，FAM为荧光报告基因，BHQ1为荧光淬灭基因；

针对CD2v基因的荧光探针CD2v-P1，如下所示：

探针CD2v-P1：VIC-TCCACTTCCATACATGAACCATCTCCAGA-BHQ1，其为SEQ ID NO.6序列，VIC为荧光报告基因，BHQ1为荧光淬灭基因。

3.一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括上述针对p72基因的扩增引物、针对CD2v基因的扩增引物、p72基因的探针p72-P1，CD2v基因的探针CD2v-P1、探针法荧光定量检测试剂、阳性对照和阴性对照。

4.如权利要求3所述的一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒反应体系中上游引物p72-F1、下游引物p72-R1、上游引物CD2v-F1和下游引物CD2v-R1的浓度分别为0.1-1μM，探针p72-P1和探针CD2v-P1的浓度分别为0.1-1μM。

5.一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检测方法，其特征在于，利用如权利要求3或4任一所述的试剂盒进行非洲猪瘟病毒检测，区分野毒感染和含有CD2v基因缺失的疫苗毒株。

6.如权利要求5所述的一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)样品处理：当待检样品为猪血液、脾脏、淋巴结、肾脏、拭子等样品时，可直接采用全自动核酸提取试剂盒或DNA提取试剂盒提取DNA，形成待检DNA备用；

(2)反应体系配制：将ASFV Mix和酶系反应液瞬时离心后，将ASFV Mix反应液全部转移到酶系管中，震荡混匀或颠倒混匀，充分混匀后瞬时离心，然后分装到每个PCR反应管中各15μL；其中，ASFV Mix试剂中包括p72基因的上下游引物、CD2v基因的上下游引物、荧光探针、buffer和过滤水；

(3)分别取10μL待检DNA、10μL阴性对照和10μL阳性对照加入到不同的PCR反应管中，加样结束后盖紧PCR反应管，震荡或颠倒混匀之后瞬时离心，每个PCR反应管内液体的体积为25μL阳性对照和阴性对照，置于室温下完全融解，充分颠倒混匀后短暂离心；

(4)PCR操作：将瞬时离心好的PCR反应管放入荧光PCR检测仪内，按照反应设置并做好标记后进行检测；FAM通道和VIC通道下阳性对照应同时出现典型的扩增曲线且CT值均＜35，且阴性对照无扩增曲线或无CT值出现，则为有效检测；

(5)结果判定。

7.如权利要求6所述的一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中反应设置如下：第一阶段，95℃预变性3分钟；第二阶段，95℃变性10秒，60℃延伸30秒，共45个循环；荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行；p72基因选择FAM荧光检测通道，CD2v基因选择VIC荧光检测通道。