[发明专利]一种针对糜子GBSSI基因开发的功能标记

说明书

本发明提供了一种针对糜子GBSSI基因开发的功能标记，涉及分子标记技术领域。本发明提供了一组用于糜子基因分型的SNP‑CAPS分子标记，命名为RYW215和RYW216。本发明还结合SNP‑CAPS分子标记和InDel标记(RYW214)进行糜子直链淀粉含量的鉴定和预测，解决非特异性延伸问题，缩短目标片段长度，配合增加胶浓度、降低电源电压方法将15bp的片段差异区分开来。利用本发明所述功能标记可鉴定糜子的粳糯性，并判定直链淀粉含量与基因型的关系，从而为新品种的选育提供检测工具。

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种针对糜子GBSSI基因开发的功能标记。

背景技术

糜子(Panicum miliaceum L.)是禾本科黍属作物，异源四倍体，具有耐旱、耐瘠、抗盐碱等优良特性。由于其抗逆性强、生育期短，广泛种植于干旱、半干旱地区。糜子起源于中国黄河流域黄土高原，种植历史达10300年，山西是糜子的起源中心。近年来，土壤干旱、盐渍等问题日益突出，基于糜子耐旱、耐盐碱等特性建立系统鉴选体系为盐碱地修复提供了重要资源，Yuan等^[1-2]从转录组和蛋白组层面揭示了糜子抗逆、耐盐碱的生理机制。糜子又有粳糯糜子之分，糯糜子称为黍子，籽粒脱壳产品为黄米，因其口感软糯，风味较好，常用来做枣糕、油糕等食品；粳性糜子籽粒脱壳后称糜米，用来制作炒米。依据颖果胚乳中直链淀粉含量，将直链淀粉含量3.7％的划归糯性糜子。

粳糯性状主要由Waxy基因控制，Waxy基因又名蜡质基因，在谷类作物中具有编码直链淀粉合成过程中的关键酶-颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)的作用。目前，编码GBSS的基因已在水稻、小麦、玉米、薯类等多种作物中克隆。禾谷类作物糯质性状多由Waxy基因变异导致，研究发现玉米Waxy基因包含14个外显子和13个内含子，其糯质受到隐性Waxy基因控制^[3]。徐春燕等^[4]以玉米昌7-2、Mo17、B73为试验材料，克隆Waxy基因并测序，对胚乳淀粉体进行纯化结果发现，GBSSI蛋白第155位氨基酸的改变减弱了与淀粉的结合度；并对第4外显子的SNP位点和第7外显子的缺失位点进行了分子标记开发。小麦Waxy基因启动子区和5’非翻译区存在413bp的InDel序列，该序列的缺失与基因表达相关^[5]。在水稻GBSS基因第一内含子剪切位点上游55bp处存在一个(CT)n重复序列，以92份美国水稻为材料，分析了Waxy基因相关SSR的多态性与直链淀粉含量的关系，检测了(CT)₈到(CT)₂₀等多个等位变异，发现基因型(CT)₁₈品种直链淀粉含量最低^[6-7]。Kawase等^[8]研究发现糯性/低直链淀粉含量谷子起源于东亚和东南亚，由当地人喜好选择驯化而来。Fukunaga等^[9]通过Southern杂交，依据谷子Waxy基因插入序列的不同将其划分为7种类型(I～VII)，其中III、IV、V和VII中插入序列较大。粳糯糜子胚乳中都含有Waxy编码蛋白，只是相对于粳性植株而言，糯性品种中缺乏GBSSI活性。早在2009年，Graybosch等^[10]对糯性糜子材料(陇糜16和陇糜18)的胚乳性质进行研究发现，糯性性状由2个隐性等位基因控制。Hunt等^[11]对糜子Waxy基因进行测序发现，Waxy基因以L和S(GBSSI-L和GBSSI-S)两种形式存在，在GBSSI-S基因外显子10附近存在15bp的缺失(野生型为S₀，突变型为S_-15)，该缺失与GBSSI失活效应间存在对应关系，即与糯性胚乳相对应；在GBSSI-L基因上观察到2个多态性位点，位于外显子9处的移码突变(腺嘌呤残基的插入/缺失)，以及位于外显子7处的SNP位点突变(A替换G)，该基因不存在移码突变和SNP位点突变的基因型L_C。2013年，Hunt等^[12]利用I2-KI显色反应，发现S_-15/L_C基因型的糜子品种胚乳细胞淀粉粒外部被染成红色，内部被染成蓝色，说明该基因型具有中间表型，L_C等位基因可以催化合成直链淀粉蛋白，因此，L和S等位基因对糜子胚乳结构均具有调控作用。Wang等^[13]对中国132份糜子材料Waxy基因的多态性位点进行PCR扩增，基于测序结果进行材料的基因型分型，证实了S_-15基因型的突变对糜子胚乳质地的改变是必须的，该研究未发现S_-15/L_C的部分糯性品种。