[发明专利]用于稻田节肢动物群落研究的环境DNA宏条形码测序法

说明书

本发明公开了一种稻田节肢动物eDNA宏条形码测序的方法，包括以下步骤：1)、设定稻田节肢动物eDNA的取样；2)、设定PCR扩增所用的引物；3)、将步骤1)取样所得样品进行DNA的提取，所得模板DNA利用步骤2)所得引物进行PCR扩增；4)、步骤3)所得的PCR产物先进行纯化，而后进行高通量测序。本发明的方法可以快速高效实现稻田节肢动物种类鉴定。

技术领域

本发明属于分子生态学领域，涉及用于稻田节肢动物群落研究的环境DNA宏条形码测序方法。

背景技术

稻田节肢动物群落研究对于提高稻田生态系统稳定性和多样性至关重要。传统的稻田节肢动物群落研究大多数是基于对所采集的所有节肢动物种类鉴定与数量测定的基础上而开展的，需要耗费大量的精力，且鉴定人员需要丰富的经验，难以实现节肢动物群落种类与数量的全貌和精准确定。同时传统的取样方法在取样过程中会对原有稻田生态系统造成影响。基因测序技术和生物信息学的发展，可以高效精准地完成物种分子鉴定，为生态学调查提供了新的研究方法和思路(Wilson et al.,2019)。高通量测序技术可以对各种环境样本DNA(environmental DNA,eDNA)进行快速测序，将测序数据与已有的DNA条形码相结合形成了eDNA宏条形码技术(eDNA metabarcoding)(Coissac et al.,2012)。eDNA是指生物释放到水、空气及土壤等环境中的短DNA片段，目前eDNA宏条形码技术已经在淡水和海洋生态系统生物多样性调查、入侵生物监测等方面发挥着重要作用(徐浩等,2014；Deiner etal.,2017)。对海洋牡蛎礁进行取样，采用线粒体细胞色素氧化酶COI基因对样品进行PCR扩增，之后通过高通量测序鉴定出体型极其微小且罕见的海洋底栖生物(Leray andKnowlton,2015)。Goldberg等(2013)运用eDNA宏条形码测序发现了一种新入侵新西兰的淡水螺Potamopyrgus antipodarum。

近年来，这项技术也开始应用于陆地生态系统节肢动物群落生态学研究中。通过收集牧草的花朵进行高通量测序，可以较为快速准确的计算出草原上节肢动物群落的组成和物种相对丰富度(Thomsen and Sigsgaard,2019)。陆地生态系统eDNA宏条形码测序对于取样方法有较高的要求，Valentin等(2020)采用“喷雾收集法”和“树干滚筒法”两种新方法收集了植被表面的eDNA，用于调查森林中入侵害虫斑衣蜡蝉Lycorma delicatula的种群数量。目前，eDNA宏条形码在稻田生态系统中的应用还未有报道，因此本行业期待建立稻田eDNA宏条形码测序的方法体系，从而期待大大提高稻田节肢动物群落调查的效率和精准度。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种用于稻田节肢动物群落研究的环境DNA宏条形码方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种稻田节肢动物eDNA宏条形码测序的方法，其包括以下步骤：

1)、设定稻田节肢动物eDNA的取样；

2)、设定PCR扩增所用的引物；

3)、将步骤1)取样所得样品进行DNA的提取，所得模板DNA利用步骤2)所得引物进行PCR扩增；

4)、步骤3)所得的PCR产物先进行纯化，而后进行高通量测序。

作为本发明的稻田节肢动物eDNA宏条形码测序的方法的改进：

所述步骤1)中：取样包括水稻抽穗期的稻田土层、稻田水层、水稻植株清洗液、水稻花粉。优先推荐采用水稻植株清洗液eDNA作为稻田节肢动物群落多样性研究。

作为本发明的稻田节肢动物eDNA宏条形码测序的方法的进一步改进：

当取样为稻田土层时，对水稻抽穗期的稻田土壤，用60mL环刀进行取样；

当取样为稻田水层时，对水稻抽穗期的稻田水，用50mL离心管进行取样；