[发明专利]用于稻田节肢动物群落研究的环境DNA宏条形码测序法

权利要求书

1.稻田节肢动物eDNA宏条形码测序的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、设定稻田节肢动物eDNA的取样；

2)、设定PCR扩增所用的引物；

3)、将步骤1)取样所得样品进行DNA的提取，所得模板DNA利用步骤2)所得引物进行PCR扩增；

4)、步骤3)所得的PCR产物先进行纯化，而后进行高通量测序。

2.根据权利要求1所述的稻田节肢动物eDNA宏条形码测序的方法，其特征在于：

所述步骤1)中：取样包括水稻抽穗期的稻田土层、稻田水层、水稻植株清洗液、水稻花粉。

3.根据权利要求2所述的稻田节肢动物eDNA宏条形码测序的方法，其特征在于：

当取样为稻田土层时，对水稻抽穗期的稻田土壤，用60mL环刀进行取样；

当取样为稻田水层时，对水稻抽穗期的稻田水，用50mL离心管进行取样；

当取样为水稻植株清洗液时，对水稻抽穗期的水稻单株用1000mL去离子水对植株根部以上进行清洗，收集清洗液；

当取样为水稻花粉时，对水稻抽穗期的稻穗收集花粉。

4.根据权利要求1～3任一所述的稻田节肢动物eDNA宏条形码测序的方法，其特征在于：

PCR扩增所用的引物为mlCOIintF/jgHCO2198R；

mlCOIintF：GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC

jgHCO2198R：TAAACTTCAGGGTGACCAAARAAYCA。

5.根据权利要求4所述的稻田节肢动物eDNA宏条形码测序的方法，其特征在于：

扩增体系为：5×FastPfu Buffer 4μL，dNTPs 2μL，Forward Primer0.8μL，ReversePrimer0.8μL，FastPfu Polymerase 0.4μL，模板DNA 10ng，加ddH₂O至20μL；

反应条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，共35个循环；72℃10min。

6.根据权利要求5所述的稻田节肢动物eDNA宏条形码测序的方法，其特征在于：

当为稻田土层样品时，采用HiPure Soil DNA Kit提取DNA；

当为水稻花粉样品时，采用HiPure Universal DNA Kit提取DNA；

当以水稻植株清洗液和稻田水层为样品时，先采用孔径0.45μm的微孔滤膜进行抽滤，之后将滤膜剪碎裂解，采用HiPure Water DNA Kit提取DNA。

7.根据权利要求1～6任一所述的稻田节肢动物eDNA宏条形码测序的方法，其特征在于：

将步骤4)高通量测序结果中得到的OTU序列与NCBI网站的nt公共数据库进行比对，从而获得取样样品中的稻田节肢动物种类。