[发明专利]一种长循环肾靶向细胞外囊泡的构建及其应用

说明书

本发明涉及药物递送(载体)领域，特别涉及一种长循环肾靶向细胞外囊泡的构建及其应用。本发明提供了一种ABP‑Lamp2b融合表达载体，以及由所述的融合载体转染细胞后产生表面展示有ABP的细胞外囊泡(ABP‑EVs)。本发明还提供了ABP‑EVs的基本特征鉴定，ABP‑EVs与白蛋白结合的检测。此外，本发明还提供了前述细胞外囊泡在小鼠体内分布的检测。其中，所述的载体转染293T细胞后，可以将ABP展示在细胞外囊泡表面，所述细胞外囊泡因表面携带ABP可以和白蛋白结合，延长体内循环时间，提高细胞外囊泡在多器官的组织驻留，可用于多种疾病的给药系统。

技术领域

本发明涉及药物载体技术领域，特别涉及一种长循环肾靶向细胞外囊泡的构建及其应用。

背景技术

胞外囊泡(Extracellular vesicle,Evs)是一种活细胞分泌的纳米级微囊泡，直径约为40-200nm，具有脂质双层膜结构。EVs具有多种内容物，包括核酸(DNA、microRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA、mtDNA等)、蛋白质、脂质、小分子代谢物等。EVs可以进入体液循环中被不同的组织细胞吸收，实现细胞间的物质和信息传递，参与对受体细胞基因表达水平的调控，最终影响受体细胞的生理功能。作为一种细胞来源的天然纳米颗粒，EVs在体内具有很好的稳定性，并维持其内含物的生物活性。EVs可通过体内多种生物屏障包括血脑屏障、肺循环等。此外，相较于脂质体、无机材料和金属材料等其它合成的纳米颗粒，EVs具有更低的免疫源性和细胞毒性，因此，EVs目前已被广泛用作药物递送的载体应用于组织修复和再生医学中。

虽然EVs已在药物递送治疗疾病中表现出良好的应用前景，但是天然未修饰的EVs经系统给药后，容易被内皮系统、巨噬细胞等清除，难以维持足量完整到达靶器官/细胞发挥作用。因此，有必要对EVs进行功能化修饰，以提高其体内半衰期和靶向性。

胞外囊泡表面展示技术是近年来研究者构建靶向EVs的常用技术。即利用基因工程技术将编码靶向肽的cDNA序列插入到编码EVs跨膜蛋白序列之间，使靶向肽与EVs跨膜蛋白一起表达，从而使靶向肽展示在EVs表面。溶酶体膜相关蛋白-2(Lamp2b)，以及跨膜蛋白CD63、CD9等已被用于靶向肽、配体、蛋白等的胞外囊泡展示。

白蛋白是血浆中最丰富的的蛋白质，在人类的半衰期达19天。研究表明与白蛋白结合是一种有效延长药物体内循环时间的方法。例如，与未修饰的阿霉素相比，偶联有白蛋白结合肽段(ABP)的阿霉素其体内循环时间更长，在BALB/c裸鼠C26结肠癌和MIAPaCa-2胰腺癌模型中均体现出更好的抗肿瘤效果。此外，研究报道ABP肽段RLIEDICLPRWGCLWEDD与人、大鼠、小鼠等多种属来源的血清白蛋白具有良好的结合能力，体内循环时间长。此外，D3H44的抗组织因子Fab与白蛋白结合肽段融合后，其结合组织因子的能力不受影响，并由于与白蛋白的结合而显著提升了体内半衰期。

肾脏近端小管细胞，是体内白蛋白吸收的重要细胞。有研究报道，相较于未修饰的法尼基硫代水杨酸，装载在牛血清白蛋白纳米颗粒的法尼基硫代水杨酸显著富集于纤维化肾脏，从而提升其对肾脏纤维化的治疗效果。此外，白蛋白衍生片段可以显著抑制肾小管细胞及肾脏对白蛋白、minigastrin、exendin等的摄取。以上研究就提示与白蛋白结合是提升细胞外囊泡体内循环和肾靶向的有效策略。

基于以上研究背景，本发明提供一种将白蛋白结合肽段展示在细胞外囊泡表面，提升细胞外囊泡与体内白蛋白的结合，从而延长其在体内的循环时间，并利用肾脏细胞对白蛋白的吸收，提升细胞外囊泡作为载药体系向肾脏递送药物的疗效。

发明内容

有鉴于此，本发明提供ABP-Lamp2b融合基因、表达载体、表面展示有ABP的细胞外囊泡的构建及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供了编码白蛋白结合肽段(ABP)的核酸分子，其具有：