[发明专利]一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探针组合及其应用

说明书

本发明公开了一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探针组合，所述引物对和探针分别针对金黄色葡萄球菌rpoB基因、链球菌tuf基因、牛支原体oppD/F基因、产色葡萄球菌sodA基因、大肠杆菌79号基因，序列如SEQ ID NO:1‑15所示。本发明公开的引物对和探针组合能够对临床奶样或其它样本中的金黄色葡萄球菌、链球菌(无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌)、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌同时进行检测，不仅能提高检测效率，而且还具有较高的灵敏度和特异性。

技术领域

本发明属于病原检测领域，涉及一种用于检测牛乳腺炎病原的引物对和探针组合，本发明还涉及所述引物对和探针组合的应用以及一种非诊断目的检测多种牛乳腺炎病原的TaqMan实时荧光定量PCR方法。

背景技术

牛乳腺炎是制约全球奶牛养殖业发展的最重要疾病之一，不仅造成巨大经济损失，包括牛奶产量减少、牛奶质量下降以及额外的治疗和处理成本，治疗时抗生素滥用及多耐药菌产生严重威胁公共卫生安全威胁。在全球范围内，奶牛临床型乳腺炎发病率约为30％，亚临床型乳腺炎患病率为15％-75％(Molineri et al.,Prev Vet Med,2021,188:105261)。引起牛乳腺炎的病原菌种类较多，在我国，金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌，它们引起了绝大多数的牛乳腺炎(Song X et al.,Veterinary Microbiology,2020,247:108757；Liu Y et al.,Prev VetMed,2020,182:105106)。准确鉴定牛乳腺炎病原菌，有利于早期发现与及时治疗。

目前国内奶牛乳腺炎发病率高，且缺乏准确高效诊断方法。常用的微生物培养法被认为是“金标准”，但是存在耗时长(5-7天)、准确度低及对操作人员要求高的缺点；血清学检测方法如ELISA、免疫胶体金技术等则存在诊断“窗口期”，动物机体产生相应的检测靶标需要一定周期；普通PCR应用最为广泛，但扩增后需要电泳及测序才能得到结果。

由于在奶牛乳腺炎诊断领域缺乏单管多重病原一次性检测方法，而荧光定量PCR已广泛用于动物病原检测，基于该技术可实现多病原、结果可视化检测。因此本研究将检测临床需要与方法结合，建立一种可以检测牛乳腺炎七种主要病原的TaqMan荧光定量PCR方法，填补实验室奶牛乳腺炎病原检测以及临床应用的空白，具有较大的经济效益与社会效益。

发明内容

本发明为解决目前牛乳腺炎病原检测操作复杂的难题，提供了一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探针组合，本发明提供的引物对和探针组合能够对临床奶样或其它样本中的金黄色葡萄球菌、链球菌(无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌)、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌同时进行检测，不仅能提高检测效率，而且还具有较高的灵敏度和特异性。

本发明提供的引物对和探针组合分别针对金黄色葡萄球菌rpoB基因、链球菌tuf基因、牛支原体oppD/F基因、产色葡萄球菌sodA基因、大肠杆菌79号基因进行设计，其中，

针对金黄色葡萄球菌rpoB基因的引物对序列如SEQ ID NO:1-2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；

针对链球菌tuf基因的引物对序列如SEQ ID NO:4-5所示，探针序列如SEQ ID NO:6所示；

针对牛支原体oppD/F基因的引物对序列如SEQ ID NO:7-8所示，探针序列如SEQID NO:9所示；

针对产色葡萄球菌sodA基因的引物对序列如SEQ ID NO:10-11所示，探针序列如SEQ ID NO:12所示；

针对大肠杆菌79号基因的引物对序列如SEQ ID NO:13-14所示，探针序列如SEQID NO:15所示。

其中，所述探针的5′端标记报告基团，3′端标记猝灭基团。