[发明专利]一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探针组合及其应用

权利要求书

1.一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探针组合，其特征在于：所述多种牛乳腺炎病原是金黄色葡萄球菌、链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌，所述引物对和探针分别针对金黄色葡萄球菌rpoB基因、链球菌tuf基因、牛支原体oppD/F基因、产色葡萄球菌sodA基因、大肠杆菌79号基因，其中，

针对金黄色葡萄球菌rpoB基因的引物对序列如SEQ ID NO:1-2所示，探针序列如SEQID NO:3所示；

针对链球菌tuf基因的引物对序列如SEQ ID NO:4-5所示，探针序列如SEQ ID NO:6所示；

针对牛支原体oppD/F基因的引物对序列如SEQ ID NO:7-8所示，探针序列如SEQ IDNO:9所示；

针对产色葡萄球菌sodA基因的引物对序列如SEQ ID NO:10-11所示，探针序列如SEQID NO:12所示；

针对大肠杆菌79号基因的引物对序列如SEQ ID NO:13-14所示，探针序列如SEQ IDNO:15所示。

2.如权利要求1所述的引物对和探针组合，其特征在于：所述探针的5′端标记报告基团，3′端标记猝灭基团。

3.如权利要求2所述的引物对和探针组合，其特征在于：针对金黄色葡萄球菌rpoB基因的探针5′端标记的报告基团是FAM，3′端标记的猝灭基团是BHQ1；

针对链球菌tuf基因的探针5′端标记的报告基团是VIC，3′端标记的猝灭基团是BHQ1；

针对牛支原体oppD/F基因的探针5′端标记的报告基团是CY5，3′端标记的猝灭基团是BHQ2；

针对产色葡萄球菌sodA基因的探针5′端标记的报告基团是Texas red，3′端标记的猝灭基团是BHQ2；

针对大肠杆菌79号基因的探针5′端标记的报告基团是CY5.5，3′端标记的猝灭基团是BHQ3。

4.权利要求1-3任一项所述的引物对和探针组合在非诊断目的检测多种牛乳腺炎病原中的应用，所述多种牛乳腺炎病原是金黄色葡萄球菌、链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述链球菌是无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌。

6.一种检测多种牛乳腺炎病原的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含权利要求1-3任一项所述的引物对和探针组合。

7.一种非诊断目的检测多种牛乳腺炎病原的TaqMan实时荧光定量PCR方法，其特征在于：该方法包括以检测样品为模板，加入反应液、超纯水和权利要求1-3任一项所述的引物对和探针组合并进行PCR扩增的步骤。

8.如权利要求7所述的检测多种牛乳腺炎病原的TaqMan实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：2×Probe PCR Master Mix 10μL；针对金黄色葡萄球菌rpoB基因的上下游引物终浓度均为450nmol/L、探针终浓度为175nmol/L；针对链球菌tuf基因的上下游引物终浓度均为450nmol/L、探针终浓度为125nmol/L；针对牛支原体oppD/F基因的上下游引物终浓度均为400nmol/L、探针终浓度为175nmol/L；针对产色葡萄球菌sodA基因的上下游引物终浓度均为400nmol/L、探针终浓度为125nmol/L；针对大肠杆菌79号基因的上下游引物终浓度均为400nnol/L、探针终浓度为200nmol/L；模板5μL，ddH₂O补足至20μL。

9.如权利要求7所述的检测多种牛乳腺炎病原的TaqMan实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为，37℃污染消化2min；95℃预变性30s，1个循环；95℃10s，56.7℃退火30s，40个循环。