[发明专利]一种转铁蛋白细胞转染方法

说明书

本申请涉及重组蛋白领域，更具体地说，它涉及一种转铁蛋白细胞转染方法。一种转铁蛋白细胞转染方法，包括以下步骤：步骤1)：准备表达载体和细胞，备用；步骤2)：将转染缓冲液与表达载体轻混匀，得到第一混合液；将转染缓冲液与转染试剂混匀，得到第二混合液；步骤3)：将第一混合液、第二混合液混匀，得到复合物；步骤4)：将复合物加到含有细胞的培养基内，滴加完成后，将细胞转移悬浮培养；其中，转染试剂包括以下原料：1,2‑二油醇‑3‑二甲基氨基‑丙烷、磷脂酰乙醇胺、三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚硫酸酯铵盐、聚乙烯亚胺、阳离子聚丙烯酰胺、脂质助剂。本申请具有提高制备重组转铁蛋白的细胞转染效率的优点。

技术领域

本申请涉及重组蛋白领域，更具体地说，它涉及一种转铁蛋白细胞转染方法。

背景技术

蛋白质作为生命科学的重要组成部分和生命功能的重要执行者，与许多基础研究息息相关。随着生命科学研究不断深入，重组蛋白的基础研究现正蓬勃发展。

重组蛋白的产生是应用了重组DNA或重组RNA的技术从而获得的蛋白质。其主要是通过质粒转染使得工程细胞携带有目的蛋白基因片段，再利用细胞培养表达目标蛋白。重组蛋白的活性、纯度都较天然蛋白的高，且更容易吸收、安全性也更好。

转铁蛋白主要由肝细胞合成，半寿期为7d，是血浆中主要的含铁蛋白质，转铁蛋白可逆地结合多价离子，包括铁、铜、锌、钴等。不同的细胞系转染的效率通常有较大的差别，因此，有必要单独寻求一种转染效率高的重组转铁蛋白的方式。

发明内容

为了提高制备重组转铁蛋白的细胞转染效率，本申请提供一种转铁蛋白细胞转染方法。

本申请提供的一种转铁蛋白细胞转染方法采用如下的技术方案：

一种转铁蛋白细胞转染方法，包括以下步骤：

步骤1)：准备质粒为TF-Histag/pcDNA3.1(+)的表达载体和细胞，备用；

步骤2)：将4-6ml的转染缓冲液与90-115μg表达载体轻轻混匀，得到第一混合液，备用；将4-6ml的转染缓冲液与490-510μL转染试剂轻轻混匀，得到第二混合液，备用；

步骤3)：将第一混合液、第二混合液轻轻混匀，静置得到复合物；

步骤4)：将复合物缓慢滴加到含有细胞的培养基内，滴加完成后，将细胞转移至35-39℃的4-6％CO₂内悬浮培养；

其中，转染试剂包括以下原料：12-20ng/ml的1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷、4-8ng/ml的磷脂酰乙醇胺、1.2-2.5ng/ml的三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚硫酸酯铵盐、6-9ng/ml的聚乙烯亚胺、5.5-7.5ng/ml的阳离子聚丙烯酰胺、1.8-3.0ng/ml的脂质助剂。

优选的，所述转染试剂包括以下原料：15-18ng/ml的1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷、5.5-6.8ng/ml的磷脂酰乙醇胺、1.8-2.2ng/ml的三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚硫酸酯铵盐、7.5-8.5ng/ml的聚乙烯亚胺、5.5-6.0ng/ml的阳离子聚丙烯酰胺、1.8-3.0ng/ml的脂质助剂。

通过采用上述技术方案，选择特定的1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷、磷脂酰乙醇胺、三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚硫酸酯铵盐在特定比例下配合使用，提高了1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷、磷脂酰乙醇胺上所携带的正电与TF-Histag/pcDNA3.1(+)的表达载体上的负电基团结合的稳定性和广泛性，形成了多个结构稳定的复合体，从而更加容易被细胞内吞以完成瞬时性转染，以此提高转染效率。

且本申请采用先把表达载体、转染试剂分别用转染缓冲液配置好，然后再混合在一起的方式得到复合物，再把复合物滴加到细胞的培养基内，使表达载体与转染试剂能够在恰当的时候充分反应，从而有利于后续形成稳定的复合物。