[发明专利]一株高产生育酚的重组裂殖壶菌工程菌的构建方法及应用

说明书

本发明提供高产生育酚的重组裂殖壶菌，所述重组裂殖壶菌是在裂殖壶菌中通过表达乙酰辅酶A合酶基因(ACS)、乙醛脱氢酶6基因(ALD6)和GGPP合成酶基因(crtE)构建而成的。本发明通过过表达ACS、ALD6和crtE基因达到提高乙酰辅酶A含量和GGPP含量，同时对启动子进行突变，筛选有益突变体对关键基因进行表达，来提高生育酚的合成。采用本发明的裂殖壶菌重组菌株ATCC‑20890进行发酵合成的总生育酚含量达到611.7μg/g DCW，其中γ‑生育酚含量达到365.5μg/g DCW，α‑生育酚含量达到246.2μg/g DCW，在原始菌株ATCC20889的基础上提高了3.5倍。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产生育酚的重组工程菌株，还涉及所述重组菌株的构建方法，及其在生产生育酚中应用。

技术背景

维生素E(Vitamin E)是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚(tocopherol)，是最主要的抗氧化剂之一。维生素E的应用领域非常广泛，可以添加在化妆品、护肤品中，还可以作为医疗保健品预防各种疾病，在动植生命中有着不可替代的重要地位，故而人类对维生素E的需求量巨大。但是目前的一些化学合成、生物提取的方法存在收率低、纯度不高、浪费较大、易污染环境、设备昂贵、操作复杂及质量差等问题。因此，通过生物技术手段调控一些关键酶基因的表达，成为天然生育酚合成的新途径。

裂殖壶菌(Schizochytrium)是一类海洋异养微生物，其单细胞内能够积累大量对人体有益的活性物质，这些活性物质合成所用到的共同前体物质乙酰辅酶A在裂殖壶菌中含量比较高，而乙酰辅酶A也是生育酚合成上游过程中的一个关键前体物质，所以我们尝试在已成功构建生育酚合成通路的裂殖壶菌中调控关键基因的表达来调节前体物质的合成，从而提高裂殖壶菌中生育酚含量。

本专利通过在已成功构建生育酚合成通路的裂殖壶菌中过表达乙酰辅酶A合酶(ACS)和乙醛脱氢酶6基因(ALD6)达到提高乙酰辅酶A含量的目的，同时过表达GGPP合成酶基因(crtE)以提高GGPP含量，从而提高生育酚含量，得到一株能高产生育酚的裂殖壶菌重组菌株。

发明内容

本发明的目的是提高裂殖壶菌中生育酚含量，通过对生育酚合成途径中关键基因的过表达，从而促进生育酚的合成，提供一种高产生育酚的重组工程菌株，以及该重组菌株的构建方法和应用。

本发明的思路是通过在已成功构建生育酚合成通路的裂殖壶菌中调控关键基因的表达来调节前体物质的合成，过表达乙酰辅酶A合酶(ACS)、乙醛脱氢酶6基因(ALD6)和GGPP合成酶基因(crtE)达到提高乙酰辅酶A含量和GGPP含量，同时对启动子进行突变，筛选有益突变体对关键基因进行表达，从而提高裂殖壶菌中生育酚含量，得到一株能高产生育酚的裂殖壶菌重组菌株，其合成路线如图1所示。

基于此，本发明提供高产生育酚的重组裂殖壶菌，所述重组裂殖壶菌是在裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC20889中通过表达乙酰辅酶A合酶基因(ACS)、乙醛脱氢酶6基因(ALD6)和GGPP合成酶基因(crtE)的构建而成的。

在本发明中，所述乙酰辅酶A合酶基因(ACS)和乙醛脱氢酶6基因(ALD6)构建的表达盒中分别含有启动子TEFp-2，启动子TEFp-2的序列如SEQ ID No.5所示；所述GGPP合成酶基因(crtE)构建的表达盒中含有启动子TEFp-3，启动子TEFp-3的序列如SEQ ID No.6所示；乙酰辅酶A合酶基因(ACS)的序列如SEQ ID No.1所示，乙醛脱氢酶6基因(ALD6)的序列如SEQ ID No.2所示，GGPP合成酶基因(crtE)的序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供上述重组裂殖壶菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：

((1)分别构建ACS基因、ALD6基因和crtE基因过表达质粒