[发明专利]一株高产生育酚的重组裂殖壶菌工程菌的构建方法及应用

权利要求书

1.高产生育酚的重组裂殖壶菌，其特征在于所述重组裂殖壶菌是在裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC20889中通过表达乙酰辅酶A合酶基因(ACS)、乙醛脱氢酶6基因(ALD6)和GGPP合成酶基因(crtE)的构建而成的。

2.根据权利要求1所述的重组裂殖壶菌，其特征在于所述乙酰辅酶A合酶基因(ACS)和乙醛脱氢酶6基因(ALD6)构建的表达盒中分别含有启动子TEFp-2，启动子TEFp-2的序列如SEQ ID No.5所示；所述GGPP合成酶基因(crtE)构建的表达盒中含有启动子TEFp-3，启动子TEFp-3的序列如SEQ ID No.6所示；乙酰辅酶A合酶基因(ACS)的序列如SEQ ID No.1所示，乙醛脱氢酶6基因(ALD6)的序列如SEQ ID No.2所示，GGPP合成酶基因(crtE)的序列如SEQID No.3所示。

3.权利要求1或2所述的重组裂殖壶菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)分别构建ACS基因、ALD6基因和crtE基因过表达质粒

根据测序获得的酰基转移酶(AT)基因序列设计引物ATup-F和ATup-R以及ATdown-F和ATdown-R扩增得到裂殖壶菌(Schizochytrium sp.ATCC20889)的上下游同源臂并连接到pJN44载体上，分别得到重组质粒pJN44-ATup和pJN44-ATdown，然后通过酶切将胶回收的ATup片段和ATdown片段连接到PBS-Zeo载体上，得到重组质粒PBS-Zeo-AT；其中，酰基转移酶(AT)基因序列如SEQ ID No.7所示；

以裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC20889基因组为模板，分别扩增获得的ACS基因、ALD6基因和crtE基因序列片段，将目的片段分别连接到载体pJN44的多酶切位点上，构建得到含有ACS表达盒的质粒pJN44-ACS、含有ALD6表达盒的质粒pJN44-ALD6和含有crtE表达盒的质粒pJN44-crtE；将质粒pJN44-ALD6和pJN44-crtE中含目的基因的表达盒进行酶切，并依次连接至质粒pJN44-ACS，得到重组质粒pJN44-ACS/ALD6/crtE，然后将重组质粒pJN44-ACS/ALD6/crtE中含目的基因的表达盒酶切并连接至载体PBS-Zeo-AT，得到重组质粒PBS-Zeo-ACS/CrtE/ALD6-AT；

(2)TEF启动子的替换

然后将TEFp-2启动子连接至pJN44-ACS/ALD6/crtE载体，分别替换ACS表达盒和ALD6表达盒原有启动子，将TEFp-3启动子连接至pJN44-ACS/ALD6/crtE载体，替换crtE表达盒的原有启动子，得到重组质粒；

(3)构建重组裂殖壶菌ATCC-20890

按照裂殖壶菌电转化方式将步骤(2)得到的重组质粒转化进入裂殖壶菌，得到重组裂殖壶菌ATCC20890。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于步骤(3)的裂殖壶菌是裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC20889，所述裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC20889同时整合了来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因GGH，和来源于小球藻的尿黑酸植基转移酶基因HPT以及来源于镰孢菌的γ-生育酚甲基转移酶基因γ-TMT。

5.权利要求1或2所述的重组裂殖壶菌在生产生育酚中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所得重组裂殖壶菌在种子培养基中，180-220rpm、27-29℃恒温摇床里培养48-72h，然后接种至发酵培养基中，180-220rpm、27-29℃恒温摇床里培养3-5d。

7.根据权利要求2所述裂殖壶菌重组菌株培养基，其特征在于所述种子培养基含有：葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸钠10g/L、KH₂PO₄ 4g/L、NaCl 15g/L、MgCl₂ 3g/L、CaCl₂·2H₂O 1g/L、KCl 2g/L、MgSO₄·7H₂O 5g/L、FeCl₃0.1g/L；

所述发酵培养基含有：葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸钠10g/L、KH₂PO₄ 4g/L、NaCl15g/L、MgCl₂ 3g/L、(NH₄)₂SO₄ 6g/L、KCl 2g/L、MgSO₄·7H₂O 5g/L、FeCl₃ 0.1g/L。